L-丙氨酰-L-谷氨酰胺环合类有关物质的测定

吴 强，刘 伟，何广卫

(合肥医工医药有限公司，安徽合肥 230601)

谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，经肠内或肠外补充谷氨酰胺可改善动物的器官功能和生存率［1－2］。但口服谷氨酰胺制剂含量少、胃肠道功能障碍病人吸收差，同时谷氨酰胺水溶性差、热压灭菌及长期储存时在化学上不稳定，故谷氨酰胺双肽作为谷氨酰胺供体的注射剂应运而生，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Ala-L-Gln)就是其中之一［3］。此类药物的临床使用剂量很大，如本品的单次使用剂量为20 g，故有关物质的定性检测显得更为重要。此类药物常见的检验方法是反相高效液相色谱法［4－6］，但通常需衍生化;或采用氨基柱［7－10］进行分析;本品药典标准［11］亦采用氨基柱进行分离，标准重视了降解产物的研究，对工艺杂质(非环合类杂质)研究相对较少，特定杂质的检测不及本研究丰富。本文采用阳离子交换色谱法，具有简单方便，专属性强等优点，避免了非环合类杂质的干扰。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪。L-焦谷氨酸(LPyr-OH)购自上海源聚生物科技有限公司，L-焦谷氨酰-L-丙氨酸(Pyr-Ala-OH)、环 L-丙氨酰-L-谷氨酸［Cyclo(-Ala-Glu)］、环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)［Cyclo(-Ala-Gln)］、L-丙氨酰-L-谷氨酸(L-Ala-LGlu)、D-丙氨酰-L-谷氨酰胺(D-Ala-L-Gln)均购自瑞士BACHEM AG公司，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺由合肥医工医药有限公司提供，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液(商品名:力太)由无锡华瑞制药有限公司生产。硫酸(分析纯)。

2 方法的建立和验证

2.1 环合类有关物质的归属 氨基酸和肽类物质的主要降解途径为环合和水解，通过分离预试验对样品的检测，结合本品结构和相关文献，并以对照品进行比对，分析得出本品的主要环合类有关物质包括:(1)L-焦谷氨酸，为L-谷氨酰胺在酸性条件下自身环合生成［3］;(2)环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，为二肽热破坏生成的环缩二氨酸［12］;(3)环-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)，为环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)在碱性加热条件下酰胺水解生成;(4)L-焦谷氨酰-L-丙氨酸，为 L-焦谷氨酸与 L-丙氨酸缩合产物。

2.2 色谱条件 色谱柱:Hypersil SCX柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:0.000 5 mol·L－1硫酸溶液;流速:0.6 mL·min－1;检测波长:215 nm。

2.3 专属性试验

2.3.1 各成分的分离情况 (1)非环合类有关物质考察:分别取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、D-丙氨酰-L-谷氨酰胺(异构体)、L-丙氨酰-L-谷氨酸(水解物，非环合类有关物质)、L-谷氨酰胺(合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的起始原料)及D-2-氯丙酰-L-谷氨酰胺(合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的唯一中间体)进样分析，除 D-2-氯丙酰-L-谷氨酰胺外(tR=5.7 min)，其余组份在10 min内均无色谱峰出现(上述组份可通过反相离子对色谱分离，环合类有关物质不干扰测定)。(2)环合类有关物质考察:L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、环-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的保留时间均在10 min内，各组份分离良好(图1 A)，D-2-氯丙酰-L-谷氨酰胺(tR=5.7 min)不干扰测定。

2.3.2 破坏性试验考察 由于环合类有关物质的产生多数与温度有关［14］，故破坏性试验主要进行了热破坏样品的制备。取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺适量，置测熔点用毛细管中，用熔点仪加热至230℃后，用水溶解并稀释制成2 g·L－1的溶液，进样分析，图谱显示(图1 B)，热破坏样品的主要环合类降解产物为环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，其余降解物质也有少量的生成，各降解峰与主药峰分离良好。

2.3.3 市售品考察 同时通过对市售力太注射液进行检测，结果显示(图1 C)经制剂工艺环合类有关物质显著增加，主要为L-焦谷氨酰-L-丙氨酸和环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。

2.4 检测限 按信噪比3∶1计，L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、环-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的检测限均约为2 ng(0.1 mg·L－1×20 μL)，结合供试品溶液浓度及相关限度，本方法供试品溶液的配制浓度及方法灵敏度满足检测要求。

2.5 线性关系考察 取 L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、环-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)对照品，分别考察其线性关系，各组份色谱峰面积与浓度的回归方程见表1，各组份在相应范围内呈良好的线性关系。

2.6 进样精密度 取各对照品溶液(约5 mg·L－1)，重复进样6次，计算L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、环-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)各组份6次主峰面积的RSD值分别为 0.91%、1.36%、0.67%、0.73%，精密度良好。

表1 线性关系考察试验结果(n=5)

2.7 准确度 取同一批L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液9份，分别定量加入环合类杂质混合标样(低、中、高各3份)，制成供试品溶液，按上述方法测定，计算回收率。L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、环-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的回收率 分别 为 101.6%、96.58%、97.30%、98.62%，方法准确度可靠。

2.8 重复性试验 取同批力太注射液，共6份，依法测定，相关检测结果的RSD值0.92% ～1.75%(n=6)。

2.9 稳定性试验 供试品溶液制备好后，每隔2 h测定1次，结果显示8 h内溶液的稳定性良好，RSD值0.84% ～1.26%(n=5)。

3 样品测定

取市售力太注射液适量，加水稀释制成2 g·L－1的溶液，作为供试品溶液;另分别精密称取L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、环-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)对照品适量，加水分别溶解并稀释成10 mg·L－1的对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品图谱如显杂质峰，分别测量供试品溶液色谱图上各环合产物的峰面积，按外标法计算供试品中各杂质含量。

结果显示，市售力太注射液(批号:80GC084)含L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、环-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)分别为0.11%、0.36%、0.02%和 0.82%。

4 讨论

4.1 流动相的选择 氨基酸以阳离子形式存在时，就可与阳离子交换树脂的磺酸交换基的负电荷相互作用。流动相的酸度越高，以阳离子形式存在的氨基酸浓度就越大，此时氨基酸在阳离子交换树脂固定相中的保留很强。故流动相的选择通过对流动相硫酸浓度调整(0～0.007 5 mol·L－1)考察各物质及溶剂(水)的分离行为，结果见表2。最终选择了0.000 5 mol·L－1的硫酸溶液为流动相。

表2 硫酸浓度对分离度的影响

4.2 注射液的制备及贮存 鉴于上述研究结果，在本品注射液制备过程中应尽量降低灭菌温度和缩短灭菌时间，或开发成注射用粉针，样品的贮存也应尽量置于低温保存。

［1］李瑞麟，杨 芳，范鲁雁.谷氨酰胺强化的全肠外营养研究进展［J］.安徽医药，2008，12(8):675 －677.

［2］岳宏林，谢 萍.添加谷氨酰胺的肠外营养应用于ICU重症颅脑损伤患者效果观察［J］.安徽医药，2013，17(2):311 －312.

［3］Abumrad NN，Morse EL，Lochs H，et al.Possible sources of glutamine for parenteral nutrition:impact on glutamine metabolism［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，1989，257(2 Pt 1):228 －234.

［4］刘文萍.HPLC法测定甘氨酰－L－谷氨酰胺有关物质［J］.中国医药导报，2008，5(11):42 －43.

［5］张晓平，杨国林，何 庆，等.柱前衍生化反相高效液相色谱法测定N－甘氨酰－L－谷氨酰胺水合物含量［J］.药物分析杂志，2002，22(2):89 －91.

［6］张云楚，王丹丹.柱前衍生化HPLC法测定N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液的含量［J］.中国生化药物杂志，2006，27(6):364－366.

［7］苏 芳，周立春，冯朴纯.高效液相色谱法测定L-谷氨酰胺及其制剂的含量［J］.药物分析杂志，2002，22(2):132 －134.

［8］何盛江，宋 力，张现涛，等.N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺及有关物质的高效液相色谱分析［J］.中国生化药物杂志，2007，28(3):197－198.

［9］莫靖欣，贺英菊，闫根全，等.HPLC测定复方谷氨酰胺肠溶胶囊中的有关物质［J］.华西药学杂志，2007，22(6):695 －696.

［10］李 洁，王惠瑾，黄国英.二肽类药物甘氨酰谷氨酰胺有关物质检测方法的研究［J］.药学研究，2013，32(4):217 －219.

［11］国家药典委员会.中国药典(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:206－207.

［12］Kopple KD，Ghazarian HG.Convenient synthesis of 2，5 － piperazinediones［J］.J Org Chem，1968，33(2):862 －864.

［13］王珍珍，于小月，李 茜，等.甘氨酰－谷氨酰胺双肽中有关物质的影响因素考察［J］.华西药学杂志，2013，28(5):482－485.