大别山区仿野生栽培茯苓中茯苓多糖和茯苓酸含量研究

2015-12-13杜方平陈卫东朱月健贾步云俞年军杨青山金传山季兆洁彭代银

安徽医药 2015年9期

杜方平，陈卫东，朱月健，贾步云，俞年军，杨青山，金传山，季兆洁，彭代银

(1.金寨县金山寨食(药)用菌种植专业合作社，安徽六安 237300;2.安徽中医药大学药学院;3.安徽道地中药材品质提升协同创新中心;4.安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽合肥 230012;5.安徽济人药业有限公司，安徽亳州 236800)

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。茯苓甘，淡，性平，归肺、脾、肾经，具有利水渗湿，健脾和胃，宁心安神等功效，用于治疗水肿，小便不利等［1］。在传统中药组方中，茯苓的配伍率极高，因而有“十方九苓”之说。一些经典的组方一直沿用至今，并与西药相结合对于一些疾病有良好的治疗效果，如桂枝茯苓汤。临床研究表明，桂枝茯苓汤对于慢性盆腔炎［2-4］、肾炎［5］以及子宫肌瘤［6］都有很好的辅助治疗效果。同时，另有研究表明，以该方为基础开发的茯苓桂枝胶囊对于月经不调不孕症有一定的治疗效果［7］。茯苓中具有多种活性成分，包括茯苓三萜，茯苓多糖、树胶、蛋白质和脂肪等。其中茯苓三萜类化合物主要包括茯苓酸、土莫酸等、茯苓多糖主要包括β-茯苓聚糖、羧甲基茯苓多糖、茯苓次聚糖、木糖醇以及纤维素等。药理研究表明，茯苓三萜的主要药理活性为抗炎，利尿，抗氧化活性以及抑菌活性［8］，而茯苓多糖的活性主要表现为能够提高机体的免疫力［9-10］。本研究采用仪器分析手段，测定大别山仿野生栽培茯苓中茯苓多糖以及茯苓酸的含量，探索不同茯苓样品中有效成分含量的差异，为茯苓药材质量标准的建立和完善以及培育具有优良遗传特性菌种提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器岛津LC-15C高效液相色谱仪:日本岛津公司;UV757CRT紫外可见分光光度计:上海精科公司;RE-2000B型旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;AB125-S型十万分之一分析天平:德国梅特勒公司;KQ-300B型超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司。

1.2 材料仿野生栽培茯苓样品6份:采集于大别山区野生环境(1号取自金寨县桃岭乡桐岗村关庙组，栽培场坐北向南，砂壤土质，海拔150 m，坡度20°;2号取自金寨县桃岭乡东冲村培塘组，栽培场坐东向西，黄砂壤土质，海拔230 m，坡度25°左右;3号取自金寨县桃岭乡秦湾村红毛田组，栽培场坐东南向西北，黄砂壤土质，海拔200 m，坡度45°左右;4号取自金寨县桃岭乡龙潭村大湾组，栽培场坐西北向东南，黄壤土质，海拔185 m，坡度35°;5号取自金寨县桃岭乡龙潭村大湾组，栽培场坐西北向东南，黄壤土质，海拔185 m，坡度35°，原生松蔸边地下3寸左右外;6号取自金寨县天堂寨镇鼓楼村，栽培场坐北向南，砂壤土细，海拔665 m，坡度30°);无水葡萄糖标准品:中国药品生物制品检定所，批号:100736-202423，纯度:100%;茯苓酸标准品:上海源叶生物科技有限公司，批号:YJ0616SA14，纯度≥98%;乙腈(色谱纯):上海星可高纯溶剂有限公司;甲醇(色谱纯):上海星可高纯溶剂有限公司;磷酸(分析纯):江苏强盛功能化学股份有限公司;

2 茯苓多糖含量研究

2.1 标准品溶液的配制精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品10.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度线，即得0.1 g·L-1的葡萄糖标准品溶液，放置于4℃条件下保存。

2.2 供试品溶液的配制精密称取过60目筛的仿野生栽培茯苓样品粉末1.0 g于具塞锥形瓶中，加入50 mL纯水，超声30 min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10 mL定容至50 mL容量瓶，即得供试品溶液。

2.3 标准曲线分别精密移取葡萄糖标准品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 试管中，补加纯水至1 mL，再加入5%苯酚溶液1 mL，浓硫酸4 mL，沸水浴25 min，冰水浴15 min。取出后，补足减失体积，在490 nm处测定其吸光度(A)，以浓度(C)对其做回归方程，回归方程为A=8.0246C-0.0019(r=0.999 5)。

2.4 精密度试验精密移取标准品溶液1.0 mL至10 mL试管中，同前法操作后，连续测定吸光度5次，RSD值为1.71%，表明该方法精密度良好。

2.5 重复性试验分别精密移取5份样品溶液1.0 mL至10 mL试管中，同前法操作后，连续测定吸光度5次，RSD值为1.03%，表明该方法重复性符合要求。

2.6 稳定性试验精密移取标准品溶液1.0 mL至10 mL 试管中，同前法操作后，于 0、1、2、3、4、5 h测定吸光度，计算RSD值，结果RSD值为0.98%，说明样品在5 h内稳定。

2.7 加样回收率试验精密移取0.5 mL已知含量的样品溶液，平行5份，分别精密加入0.5 mL葡萄糖的标准品溶液(0.1 g·mL-1)，同前法操作后，于490 nm波长下测定吸光度，计算得平均加样回收率为99.04%，RSD为0.63%，符合测定要求。

2.8 样品中茯苓多糖含量测定［11］取各仿野生栽培茯苓样品，按“2.2供试品溶液的配制”项下方法，配制供试品溶液。分别精密移取各供试品溶液0.5 mL，加纯水至1 mL加入5%苯酚溶液1 mL，浓硫酸4 mL，沸水浴25 min，冰水浴15 min。取出后，补足减失体积，在490 nm处测定其吸光度(A)，根据标准曲线计算不同仿野生栽培茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，分别为 1.259%、2.169%、2.392%、2.830%、4.186%、0.709%。

3 茯苓酸含量研究

3.1 色谱条件岛津LC-15C高效液相色谱仪(包括LC-15C高压输液泵、SPD-15C紫外检测器);色谱柱:COSMOSIL C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:乙腈∶0.4%乙酸(80∶20);柱温:30℃;进样量 20μL;流速:1.0 mL·min-1;检测波长:360 nm。见图1。

3.2 标准品溶液的配制精密称取茯苓酸标准品1.50 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，即得150 mg·L-1的标准品溶液，于4℃冰箱保存。

3.3 供试品溶液的配制精密称取过60目筛的仿野生栽培茯苓样品粉末1.0 g于具塞锥形瓶中，加入30 mL甲醇，浸泡30 min，超声90 min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10 mL容量瓶中，即得供试品溶液。

3.4 标准曲线精密移取茯苓酸标准品溶液，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成15、30、60、75、100、120、135、150、300 g·mL-1的标准系列浓度，摇匀及过滤后，进样分析，以峰面积(Y)对茯苓酸的质量浓度(X)进行线性回归，回归方程:Y=200.83X-7.8316(r=0.999 9)，表明茯苓酸在15～300 mg·L-1浓度范围内线性良好。

3.5 稳定性试验取供试品溶液分别于0、0.5、1、2、3、4、5 h进样分析，结果茯苓酸峰面积的RSD为1.45%，表明茯苓酸的供试品溶液在5 h内稳定。

3.6 精密度试验取标准品溶液150 mg·L-1，重复进样5次，测定茯苓酸峰面积，计算茯苓酸峰面积的RSD值为0.69%。

3.7 重复性试验按照“3.3供试品溶液的制备”项下方法，平行制备6份供试品溶液，进样分析，计算茯苓酸峰面积RSD值为1.74%。

3.8 加样回收率试验精密移取0.5 mL已知茯苓酸含量的供试品溶液，平行5份，每份精密加入0.5 mL茯苓酸标准品溶液(150 mg·L-1)，用流动相配成合适浓度，进样分析，计算得平均加样回收率为99.11%，RSD 为 0.53%。

3.9 样品中茯苓酸含量测定［12-13］取各仿野生栽培茯苓样品，按“3.3供试品溶液的配制”项下方法，配制供试品溶液。分别精密移取各供试品溶液0.5 mL，稀释至1.5 mL，用 0.45 μm 过滤后进样分析，记录峰面积，根据标准曲线计算不同仿野生栽培茯苓样品中茯苓酸的百分含量分别为0.697%、0.598%、0.781%、0.818%、0.777%、0.441%。

4 结果

经测定，在6个不同的大别山仿野生栽培茯苓样品中5号样品茯苓多糖的含量(4.186%)最高，4号样品的茯苓酸含量(0.818%)最高。4号和5号仿野生栽培茯苓生长地的生境是一致的，均为金寨县桃岭乡龙潭村大湾组，栽培场坐西北向东南，黄壤土质，海拔185 m，坡度35°，说明该地采用仿野生栽培技术栽培出的茯苓较其它场地更优。

5 讨论

本文建立了准确、快速且重现性好的的仿野生栽培茯苓中茯苓多糖的分光光度测定方法以及茯苓酸的HPLC分析方法，为茯苓的质量控制研究和质量标准的完善提供了参考。同时本研究筛选出了大别山区不同仿野生栽培茯苓样品中茯苓多糖与茯苓酸含量较高的茯苓样品，实验结果将为后期菌种的分离及扩繁提供依据。目前大别山区很多茯苓种植单位，并不重视茯苓菌种的筛选，尤其是对于其有效成分的含量关注的较少，严重影响了栽培茯苓的质量。因而，菌种扩繁前的有效成分的测定，对于生产高品质茯苓药材具有十分重要的意义。

［1］国家药典委员会.中国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:224.

［2］方芳.桂枝茯苓汤治疗慢性盆腔炎患者疗效分析［J］.辽宁中医药杂志，2014，41(5):936-937.

［3］张永洪.桂枝茯苓丸联合阿奇霉素、奥硝唑治疗慢性盆腔炎48例［J］.河南中医，2014，34(9):1667-1668.

［4］汪文颖，李金胜.头孢西丁与桂枝茯苓胶囊联用对盆腔炎患者的疗效评价［J］.抗感染药学，2014，11(4):384-386.

［5］范月友，赵云.桂枝茯苓汤配合蜈蚣蛋治疗肾炎蛋白尿及护理［J］.中国民间疗法，2014，22(9):46-47.

［6］付爱娟.桂枝茯苓汤联合米非司酮治疗围绝经期子宫肌瘤43例［J］.河南中医，2014，34(9):1664-1665.

［7］王晓翠，廖薇.补肾活血促卵方联合桂枝茯苓胶囊治疗月经不调不孕症临床疗效观察［J］.安徽医药，2014，18(10):1982-1984.

［8］张先淑，胡先明.茯苓三萜化合物的药理作用及临床应用研究进展［J］.重庆工贸职业技术学院学报，2011，24(4):46-50.

［9］冯亚龙，赵英永，丁凡，等.茯苓皮的化学成分及药理研究进展［J］.中国中药杂志，2013，38(7):1098-1102.

［10］王青，胡明华，董燕，等.茯苓多糖对免疫抑制小鼠粘膜淋巴组织及脾脏中CD3+和CD19+细胞变化的影响［J］.中医中药与免疫，2011，27(3):228-231.

［11］李真鹍，段启，李改云.茯苓多糖含量测定方法研究［J］.中国兽医医药杂志，2011，13(5):26-28.

［12］徐斌，昝俊峰，何丽姗，等.27种菌种茯苓中茯苓酸分析比较研究［J］.中草药，2010，41(4):647-649.