染色蒲黄中柠檬黄的检测方法研究

翟清　杨志伟　石鑫磊　范纯玲

[摘要] 目的 建立蒲黄用柠檬黄非法染色的检查方法。 方法 采用TLC法、HPLC-PAD法，对多批次蒲黄样品进行定性定量分析。 结果 经检测10批市售样品中，有6批检出柠檬黄，其含量在0.05～0.50mg/g。 结论 蒲黄染色除用化工原料金胺O外，还有用柠檬黄染色现象，本文所建立的检测方法，可以满足蒲黄用柠檬黄染色定性定量的要求。

[关键词] 蒲黄；柠檬黄；TLC法；HPLC-PDA法

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）19-69-04

[Abstract] Objective Establish inspection methods Typhae Pollen illegal stained with tartrazine. Methods The technique of TLC and HPLC-PAD were developed for qualitation and quantitative analysis mutiple batches of samples Typhae Pollen.Results After testing 10 batches of commercial samples， six batches detected in lemon yellow， its content in the 0.05-0.50mg/g. Conclusion The use of chemical raw materials except Typhae Pollen staining outside auramine， there are lemon yellow staining phenomenon， The method established in this paper， to meet with tartrazine stain Typhae Pollen qualitative and quantitative requirements.

[Key words] Typhae Pollen； Tartrazine； TLC； HPLC-PDA

蒲黄收载于《中国药典》2010年版一部，为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifolia L.、东方香蒲Typha orientalis Presl或同属植物的干燥花粉。具有止血，化瘀，通淋的功效，用于吐血，衄血，咯血，崩漏，外伤出血，经闭痛经，胸腹刺痛，跌扑肿痛，血淋涩痛[1]。为中医临床常用中药，也是多种中成药的原料药。现代研究证明具有镇痛、抗凝促凝（与浓度有关）、促进血液循环、降低血脂、防止动脉硬化、保护高脂血症所致的血管内皮损伤、兴奋收缩子宫、增强免疫力等作用，还有促进肠蠕动、抗炎、抗低压低氧、抗微生物等药理作用，临床有广泛的用途[2-4]。由于中药材市场经营比较混乱，掺杂使假现象比较严重，经过市场调查发现，蒲黄伪品多为该植物非药用部位的粉末，经过染色按正品销售使用，染色多用化工原料金胺O进行非法染色[5-8]，但由于近年来药监部门加大了中药非法染色的打击力度，金胺O染色现象有所减少，但仍有一些不法商贩将蒲黄伪品用柠檬黄非法染色。柠檬黄，又称酒石黄、酸性淡黄、肼黄。化学名称为1-（4-磺酸苯基）-4-（4-磺酸苯基偶氮）-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠盐，为水溶性合成色素。呈鲜艳的嫩黄色，是单色品种。多用于食品、饮料、化妆品、饲料、烟草、玩具、食品包装材料等的着色，也用于羊毛、蚕丝的染色及制造色淀[9]。柠檬黄不是蒲黄应有的化学成分，在药学领域主要用于胶囊壳的着色剂[10]。笔者通过TLC法，HPLC-PAD法，鉴定证明蒲黄所用染料除金胺O外，还有用柠檬黄染色问题，并建立了检查方法，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

昆山市超声仪器有限公司KQ-400KDB型超声波清洗机；Linomat 5卡玛半自动点样仪；Waters2695-2988，PAD检测器，Empower 2色谱工作站。

1.2 试药

柠檬黄对照试剂购自中国计量科学研究院，批号：10002，蒲黄对照药材购自中国食品药品检定研究院，批号121225-201003。蒲黄药材、饮片购自吉林省各地区的市售样品。薄层色谱板为硅胶G薄层色谱板，购自青岛海洋化工厂分厂；水为超纯水，经检验合格，甲醇为色谱纯，醋酸铵为分析纯。

2 方法

2.1 TLC检查

2.1.1 对照试剂溶液的制备 取柠檬黄对照试剂适量，加甲醇制成0.2mg/mL的溶液，作为对照试剂溶液Ⅰ（TLC用）。取柠檬黄对照试剂溶液Ⅰ适量，加甲醇制成50μg/mL的溶液，作为对照试剂溶液Ⅱ（HPLC用）。

2.1.2 供试品溶液的制备 取蒲黄粉末1g，加甲醇20mL，密塞，超声处理20min，滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取蒲黄对照药材1g，加甲醇20mL，密塞，超声处理20min，滤过，取滤液作为阴性对照溶液。

2.1.4 TLC试验 取上述对照试剂溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水（1︰3︰3︰1︰1）为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视。供试品色谱中，阳性样品在与对照试剂色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照在与对照试剂色谱相应的位置上，则不显相同颜色的斑点（图1）。

2.2 金胺O的HPLC-PAD法确认

2.2.1 色谱条件 色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.05mol/L醋酸铵溶液（20︰80）为流动相；采用二极管阵列检测器，检测波长为423nm。理论塔板数按柠檬黄对照试剂色谱中的主峰计算，应不低于2000。endprint

2.2.2 测定法 吸取供试品溶液与对照试剂溶液及阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图（图2）。

2.2.3 专属性检查 为了证明该方法具有专属性，将对照试剂溶液，含金胺O样品、阴性样品溶液，分别进样，进行液相色谱的考察，结果薄层色谱含有柠檬黄的样品溶液呈现与柠檬黄对照试剂保留时间相同的色谱峰；比较200～600nm波长范围的紫外-可见吸收光谱，吸收光谱相同。阴性样品溶液未检出与柠檬黄对照试剂相同的色谱峰。从而证明该补充检验方法和检验项目具有专属性。

2.3 HPLC检查方法的建立与验证

2.3.1 线性范围考察 精密称取柠檬黄对照试剂适量， 加甲醇制成5.49、10.98、21.96、43.92、87.84μg/mL的溶液，分别精密吸取10?L进样测定，以对照品进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程Y=4051375.3501X-731.5417 （r=1.0000），结果表明柠檬黄在0.0549～ 0.8784?g范围内呈线性关系，符合外标法测定的要求。

2.3.2 精密度试验 取同一供试品溶液，在同一色谱条件下，重复6次，每次10μL，注入液相色谱仪，测定其柠檬黄色谱峰面积值，计算RSD=0.1%。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，在同一色谱条件下，24h内重复进样6次，每次10?L，测定柠檬黄色谱峰面积，RSD=0.1%，结果表明24h内供试品溶液中柠檬黄基本稳定。

2.3.4 重现性试验 取同一供试品6份，分别按供试品溶液制备的方法制成供试品溶液，取对照试剂溶液及上述供试品溶液分别进样，结果6份样品均检出柠檬黄。确定所采用的检查方法具有重现性。

2.3.5 耐用性 通过用同一供试品溶液的3支色谱柱进样，证明了采用的方法在实验条件有所改变时，该方法仍然适用。

2.3.6 回收率 精密称取已知含量的供试品粉末（柠檬黄含量为0.03%）6份，每份约0.5g，分别精密加入柠檬黄对照试剂溶液（0.1098mg/mL）1.4mL，依法测定，计算回收率，测得柠檬黄的平均回收率为98.61%，RSD=0.5%。见表1。

2.3.7 样品测定 取市售姜黄样品10批，按上述方法测定柠檬黄含量，结果有6批含有柠檬黄，含量在0.05～0.50mg/g。见表2。

3 结果

薄层色谱试验中，阳性样品在与对照试剂色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照在与对照试剂色谱相应的位置上，则不显相同颜色的斑点。经过HPLC-PAD法确认，阳性样品色谱图中，在与对照试剂相同保留时间有相同的色谱峰，阴性对照无相应的色谱峰，进一步证明方法的准确性。

4 讨论

柠檬黄，为水溶性合成色素，是食品常用的染色剂之一，在不同食品中的使用限量不同，最高使用向量均为0.5mg/g，通常情况下，在常规用量下使用是安全的[9]，但不是蒲黄应有的化学成分，而是个别商贩为了销售蒲黄伪品而染的色素，并且柠檬黄对敏感人群而言，少量即可产生变态反应（包括支气管哮喘）[11]。本实验所测得的柠檬黄含量虽未超出使用的最高限量，但在临床使用仍纯在一定风险。

染色的样品均为伪品蒲黄，经过显微鉴定可以确定为该植物非药用部位的粉末加部分沙土组成[12-13]，甚至不含或少含蒲黄花粉粒，经过染色使其近似蒲黄的颜色，原来多用金胺O进行染色，由于药监部门加大了打击力度，又开始使用柠檬黄对药材非法染色。

在制备供试品溶液时，对甲醇、乙醇提取分别进行了考察，结果根据薄层色谱法所显斑点颜色深浅和液相色谱峰的大小，判断用甲醇提取，提取率较高；提取方法采用加热回流和超声处理两种方法进行考察，结果超声处理优于回流提取。

从表2可以看出，10批样品中有6批检出柠檬黄，TLC法和HPLC法测定结果一致，没有误判现象。

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（收稿日期：2015-05-27）endprint