RP—HPLC法测定肠内营养乳剂中维生素A棕榈酸酯的含量

莫鸣

[摘要]目的 采用石油醚（沸程60～90℃）作为溶剂建立萃取肠内营养乳剂（瑞素）中维生素A棕榈酸酯的方法，并利用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定其含量。 方法 使用沸程60～90℃的石油醚与肠内营养乳剂乳化后加入乙醇破乳，萃取出维生素A棕榈酸酯。以Thermo C18 （Hypersil ODS）柱（5 ?m，4.0mm×250mm）为色谱柱，以甲醇︰水（97︰3，V/V）为流动相，泵流速为2.0mL/min，检测波长为325nm，采用RP-HPLC外标法测定维生素A棕榈酸酯含量。 结果 维生素A棕榈酸酯在1.0～10.0?g/mL浓度范围内线性关系良好（r=0.9992），其精密度相对标准偏差（RSD）为2.0%（n=12）；回收率为99.51%，回收率RSD为1.2%（n=6）。 结论 RP-HPLC法简便、快速、准确、精密度好且无干扰，可用于肠内营养乳剂中维生素A棕榈酸酯含量测定。

[关键词] 反相高效液相色谱法；肠内营养乳剂；维生素A棕榈酸酯；萃取

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）19-65-05

[Abstract] Objective To establish a method for extracting vitamin A palmitate from enteral nutrition emulsion （TP） using petroleum ether （boiling range from 60 to 90℃） as a solvent， and the concentration of vitamin A palmitate was determined using reverse phase high performance liquid chromatography（RP–HPLC）. Methods The enteral nutrition emulsion was emulsified with petroleum ether， and then demulsified with ethanol for extraction of vitamin A palmitate. The concentration of vitamin A palmitate was determined using RP-HPLC external standard method on a Thermo C18 （Hypersil ODS） column（5?m， 4.0mm×250mm）at 325 nm with a mobile phase of methanol/water （97︰3， V/V）， and a flow velocity of 2.0mL/min. Results A satisfactory linear relationship was observed when the vitamin A palmitate concentration ranged from 1.0 to 10.0 ?g/mL（r=0.9992）， and the relative standard deviation （RSD） of precision was 2.0%（n=12）. The mean recovery rate was 99.51%， with its RSD of 1.2%（n=6）. Conclusion RP-HPLC is a simple， rapid and accurate method with a high precision， which can be used for the determination of vitamin A palmitate concentration in enteral nutrition emulsion.

[Key words] Reverse phase high performance liquid chromatography （RP–HPLC）； Enteral nutrition emulsion； Vitamin A palmitate； Extraction

肠内营养（EN）给药是经口服或管饲提供满足或补充代谢需要的营养基质及其他各种营养素的营养支持方式[1-2]。近年来，营养支持尤其是肠内营养支持在各种危重患者的临床应用中愈加受到重视[3-5]。肠内营养乳剂（瑞素）含蛋白质、多种水溶性维生素、脂溶性维生素及多种微量元素，其中维生素A就是其中重要的脂溶性维生素之一。通常采用紫外三点校正法测定维生素A含量[6-7]；但复方制剂中由于成分复杂、相互干扰，紫外分光光度法因专属性差而无法对复方制剂中的维生素A进行检测。既往研究显示，可应用固相萃取高效液相色谱法（HPLC）测定鱼肝油乳中维生素A含量[8-10]。但肠内营养制剂中富含蛋白质，无法固相萃取其中的维生素A。本研究建立了以石油醚（沸程60～90 ℃）为溶剂的萃取法，并利用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定肠内营养乳剂（瑞素）中的维生素A棕榈酸酯含量，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

维生素A棕榈酸酯对照品购自DSM公司（批号为0000018484，含量为1832946IU/g）；肠内营养液由华瑞制药有限公司提供，商品名瑞素（国药准字：H20020588，批号：80BF105），其处方见表1。甲醇，色谱纯，购自Merck公司；石油醚（沸程：60～90℃），分析纯，为国药集团产品；无水乙醇，分析纯，购自国药集团。1100型高效液相色谱仪及其化学工作站购自Agilent公司。

1.2 RP-HPLC测定方法

1.2.1 流动相和色谱条件 选择Thermo Hypersil ODS C18柱（5 ?m，4.0mm×250mm）为色谱柱，以甲醇︰水（97︰3，V/V）为流动相，泵流速为2.0mL/min，检测波长为325nm，进样量为20 ?L。endprint

1.2.2 对照品溶液的配制 精密称取维生素A棕榈酸酯对照品15mg，置100mL量瓶中，加石油醚溶解并稀释至刻度。精密量取1mL置100mL量瓶中，加石油醚稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

1.2.3 样品溶液的配制 精密称取瑞素样品20g（密度为1.068g/mL），加入20mL石油醚中剧烈振摇5min，加入40mL无水乙醇，再振摇3min，放置分层。取上清液为样品溶液。

1.2.4 维生素A棕榈酸酯含量测定 分别取对照品溶液和供试品溶液各20?L，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算获得维生素A棕榈酸酯含量[11-12]。

1.2.5 系统适应性试验 取样品溶液进样20?L，在325nm处测定，理论塔板数为5327，说明柱效较高，完全能满足本次实验。利用二极管阵列检测器和化学工作站，测定维生素A棕榈酸酯的峰纯因子为999.930，说明此峰中无其他未分离组分（图1）。

1.2.6 专属性试验 配制不含维生素A棕榈酸酯的阴性样品溶液，同时进样此样品溶液和1.2.2中制备的标准对照品溶液，样品溶液在维生素A棕榈酸酯处不出峰（图2）。

1.2.7 线性试验 精密称取维生素A棕榈酸酯10、15、25、50、100mg，用石油醚（沸程为60～90℃）分别溶解并制成1.00、1.50、2.50、5.00、10.00 ?g/mL溶液，取20 ?L进样，每份进样2次，以浓度（C）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标计算回归方程及相关系数（r）。

1.2.8 重复性试验 按1.2.3方法制备6份样品溶液，取样品溶液20?L进样，计算样品溶液中维生素A棕榈酸酯峰面积与样品称重比值的相对标准偏差（RSD）。

1.2.9 中间精密度试验 采用另外一台Agilent 1100型高效液相色谱仪，按上述方法测定6次，计算样品中维生素A棕榈酸酯峰面积与样品称重比值的RSD值。

1.2.10 回收率试验 称取维生素A棕榈酸酯16.5527mg，按1.2.2方法配制标准溶液，精密称定已知含量的瑞素6份各20g，分别加入20.00mL标准溶液，剧烈振摇5min，加入40.0mL无水乙醇，再振摇3min，取上清液进样，计算回收率。

2 结果

以浓度C为横坐标、峰面积A为纵坐标，计算得到线性回归方程为A=42.9971C-1.2916，相关系数r=0.9992（表2），表明维生素A棕榈酸酯在1.0～10.0?g/mL浓度范围内线性关系良好。其重复性和中间精密度试验的RSD为2.0%（n=12），表明重复性和中间精密度好（表3～4）。样品回收率为99.51%，回收率RSD=1.2%（表5），表明此方法结果准确。通过阴性样品试验和峰纯度检查说明本方法专属性较好（图1～2）。

3 讨论

肠内营养乳剂（瑞素）为复方制剂，成分复杂、干扰较多，测定时我们先使用石油醚对样品充分乳化，使得维生素A棕榈酸酯酯充分分散到石油醚中，然后使用乙醇作为破乳剂将样品充分震摇而产生破乳，最终使石油醚层与乙醇层迅速分离。对于破乳剂应先确定其是油溶性还是水溶性，水溶性破乳剂用水作为溶剂，油溶性破乳剂通常用甲醇作为溶剂，考虑到甲醇的毒性，采用无毒乙醇作为替代品，收到了良好效果[13-14]。

石油醚的沸程有30～60℃、60～90℃和90～120℃，此数值是指馏分不同，30～60℃沸程是指其中馏分的初馏点不低于30℃，终馏点不高于60℃，其他依此类推。因此，30～60℃沸程的石油醚最容易挥发，60～90℃次之，90～120℃相对不易挥发，但与样品的乳化能力稍差[15]。我们采取60～90℃沸程的石油醚，其不易挥发，又有较强和样品充分乳化的能力，能更好地萃取，故选择其作为萃取溶剂。

使用石油醚溶解维生素A棕榈酸酯在紫外分光光度计中扫描，测得其最大吸收波长为325nm[13]，故本实验采用325nm作为检测波长。样品取样采用称重而不是体积是为了取样更准确。因为肠内营养乳剂富含蛋白质和脂肪，有一定黏稠度，量取体积会增加实验误差。此外，对照品和样品溶液制备时要尽量避光或在暗光下操作，虽然维生素A棕榈酸酯的稳定性较醋酸酯高，但制备好的溶液仍尽可能快速进样分析，以防维生素A棕榈酸酯在溶液中降解[16]。

本研究建立并应用RP-HPLC法测定肠内营养乳剂中的维生素A棕榈酸酯含量，发现维生素A棕榈酸酯在1.0～10.0?g/mL浓度范围内线性关系良好（r=0.9992），重复性和中间精密度较高（RSD=2.0%）；测定结果准确，样品回收率为99.51%，回收率RSD=1.2%；且专属性较好。本研究结果表明，RP-HPLC法简便、快速、准确、精密度好且无干扰，可用于肠内营养乳剂中维生素A棕榈酸酯含量测定。

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（收稿日期：2015-05-14）endprint