大孔型离子交换树脂分离纯化右旋糖酐酶

黎志德，常国炜，黄曾慰，曾练强，梁达奉

（广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州 510316）

大孔型离子交换树脂分离纯化右旋糖酐酶

黎志德，常国炜，黄曾慰，曾练强，梁达奉*

（广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州 510316）

本试验使用大孔型离子交换树脂对来源于重组毕赤酵母的右旋糖酐酶进行分离纯化，结果表明：D151离子交换树脂能有效地吸附右旋糖酐酶，静态吸附4 h后，酶的吸附率达到53%，24 h后，吸附率达到95%；动态洗脱实验离子交换树脂可以分离酶蛋白和杂蛋白，酶的比活力提高2.43倍，但酶的回收率较低，只有8%。

右旋糖酐酶；大孔型；离子交换树脂；右旋糖酐酶

0 前言

右旋糖酐酶(Dextranase)可以专一性水解α-1,6-糖苷键，将右旋糖酐水解成小分子的寡聚糖[1]。右旋糖酐酶适合在制糖生产中使用，加入0.05 U/mL的右旋糖酐酶即可将蔗汁中浓度为800～900 mg/(kg·°Bx)的右旋糖酐完全去除[2]。同时，右旋糖酐酶在甘蔗亚硫酸法制糖[3]和原糖精炼[4]的应用性试验中均有良好的效果，可见该酶具有在工业上应用的潜力。所以，寻找一种简单易行的方法对右旋糖酐酶进行一定程度的纯化，去除多余的菌体、营养成分以及色素等杂质，避免在长时间常温存放时性状变坏[5]就显得十分有意义。离子交换树脂作为一种常用的分离材料，可用于分离短肽和蛋白质等，例如溶菌酶[6]、乳糖酶[7]、乳链球菌肽[8]。其中，Cheigh[9]等使用离子交换树脂实现一步纯化Nisin短肽。加入异丙醇到流动相对离子树脂柱进行线性梯度洗脱，可以迅速分离多种标准蛋白[10]。本文主要探讨离子交换树脂在纯化右旋糖酐酶上应用方式，并对纯化效果以及效率进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

ZK11重组毕赤酵母发酵右旋糖酐酶酶液（广州

甘蔗糖业研究所）；标准葡聚糖T-2000（美国法玛西亚公司）；柠檬酸，3,5-二硝基水杨酸（国药集团化学试剂有限公司）；硫酸镁，硫酸铵，磷酸氢二钠，硫酸铵，95%酒精，无水亚硫酸钠，酒石酸钾钠，氢氧化钠，苯酚（均为分析纯，广州化学试剂厂）；离子交换树脂D301K、D380、D303、001X7、D151、D152（华东理工大学上海华震科技有限公司）。

1.2 实验设备

AL104电子分析天平（美国Mettler公司）；Himac CR22GⅡ冷冻高速离心机（日本Hitachi公司）；Model7581型恒流泵（美国MasterFlex公司）；Vivaflow 200 PES 10000超滤膜（德国Sartorius公司）；SUKUN SKY-2102C摇床培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂）；DK-S24型电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）；2800型紫外-可见分光光度计（美国Unico公司）；BSZ-40自动部分收集器，BT100-2数显恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司）；电炉、移液枪、枪头、比色管等。

2 实验方法

2.1 酶液的前处理

将硫酸铵晶体研磨至粉末状，添加至酶液中溶解，4℃下静置过夜；取出，以12000 r/min离心10 min，分别测定上清液和沉淀物的酶活和蛋白浓度，计算出酶提取率和蛋白的总回收；按照酶提取率和蛋白回收率，选择沉淀效果最佳的硫酸铵饱和度。

将沉淀后的蛋白用pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解，再用孔径为10 kDa的超滤膜进行脱盐浓缩，并除去大部分分子量小于10 kDa的杂蛋白以及其他小分子杂质，置于4℃保存备用。酶活测定方法按DNS法，蛋白浓度测定按考马斯亮蓝G-250法[11]。

酶活定义：每分钟在标准右旋糖酐底物T-2000中释放出1 μmol还原糖所需的酶量为1个酶活单位，以U表示。

2.2 离子交换树脂的预处理

离子交换树脂先用饱和食盐水充分浸泡，然后逐步降低浸泡液中的食盐浓度直到零，酸型树脂先用1 mol/L NaOH溶液浸泡，再用1 mol/L盐酸浸泡，清洗至中性后常温保存备用；碱型树脂先用1 mol/L盐酸浸泡，再用1 mol/L NaOH溶液浸泡，同样清洗至中性后常温保存备用。

2.3 离子交换树脂的初步筛选

取按2.1节处理后的右旋糖酐酶酶液，分别加入50 mg/mL的离子交换树脂D301K、D380、D303、001X7、D151、D152，置于恒温摇床，16℃、100 r/min吸附12 h，去掉清液，用与酶液等体积，浓度为100 mg/mL的氯化钠溶液进行洗脱1 h，分别测定各样本洗脱液的A280nm值，计算出洗脱液中右旋糖酐酶回收率和蛋白回收率，选出效果最优的2种离子交换树脂。其中280 nm为蛋白特征吸收波长，A280nm值常被用于层析分离中流动相蛋白含量的快速测定[12]。

2.4 树脂用量对右旋糖酐酶静态吸附效果的影响

取2.1节处理后的右旋糖酐酶酶液，加入100、200、300和400 mg/mL从2.3节中筛选出的树脂，置于恒温摇床，16℃、100 r/min吸附1 h，去掉清液，加入等体积的10 mg/mL氯化钠溶液进行洗脱，分别测定加入树脂后的pH，各样本洗脱液的A280nm值，并计算出洗脱液中右旋糖酐酶回收率和蛋白回收率，选出最优的树脂及其用量。

2.5 吸附时间对右旋糖酐酶静态吸附效果的影响

取按2.1节处理后的右旋糖酐酶酶液，选择按2.4节中选出的最适用量加入离子交换树脂，置于恒温摇床，16℃、100 r/min进行吸附反应，在1、2、4、8、24 h后各取1次清液，测定清液中剩余的酶活，计算出酶的吸附率，选出最佳静态吸附时间。

2.6 盐溶液种类对洗脱效率的影响

取按2.5节中吸附后的离子交换树脂，用原酶液一半体积的100 mg/mL浓度的氯化钠、硫酸镁和硫酸铵溶液进行洗脱，置于恒温摇床，16℃，100 r/min洗脱1 h，取出各样本清液，测定清液中的酶活，计算出盐溶液的洗脱率，选出最佳的盐溶液。

2.7 洗脱盐溶液浓度对洗脱效率的影响

取出按2.5节吸附后的离子交换树脂，以原酶液体积的一半，加入100、200、300 mg/mL浓度的盐溶液进行洗脱，置于恒温摇床，16℃、100 r/min洗脱1 h，取出各样本清液，测定清液中的酶活，计算出盐溶液的洗脱率，选出最佳的盐溶液浓度。

2.8 洗脱时间对洗脱效率的影响

2.9 离子交换树脂动态洗脱纯化右旋糖酐酶

在长1 m、内径2.4 cm的玻璃层析柱中，装入经过预处理的树脂约150 mL，静置一段时间后确定无气泡和断层后，放入略小于层析柱内径的滤纸片保护床面。当树脂床表面仅余1 mm液层时，吸取10 mL经预处理样品，小心注入层析柱树脂床中央，待大部分样品进入树脂床后，加入大约1 cm高的蒸馏水，打开层析柱下端阀门，再小心加入约5 cm高的100 mg/mL NaCl洗脱液，开启恒流泵，流速为1 Bv/h，部分收集器收集时间为每管5 min，总收集时间为2 h。

3 结果与分析

3.1 硫酸铵沉淀右旋糖酐酶

按2.1用硫酸铵沉淀右旋糖酐酶，在不同饱和度下，右旋糖酐酶液酶提取率和蛋白提取率见图1。

图1 硫酸铵沉淀纯化右旋糖酐酶

从图中可以观察到，在硫酸铵饱和度为25%时，酶以及杂蛋白都没有沉淀，当饱和度上升至40%时溶液中的蛋白逐步沉淀下来，当饱和度到80%时酶和总蛋白提取率基本上一致，饱和度继续上升，酶的提取率上升很少，而总蛋白的提取率则明显上升，因此以80%饱和度作为沉淀条件是比较合适的。

表1 离子交换树脂的初步筛选

3.2 离子交换树脂的初步筛选

弱碱型离子交换树脂D301K、D380、D303、强酸型离子交换树脂001X7、弱酸型离子交换树脂D151、D152静态吸附12 h后洗脱结果如表1。

从表1观察到右旋糖酐酶酶液经过离子交换树脂的吸附后，D301K洗脱液的蛋白浓度最高，但酶活回收率没有相应程度的提高，证明洗下来的杂蛋白比较多；D303和D151洗脱液在蛋白浓度较高的情况下，酶活回收率也很高。此外，强酸型离子交换树脂001X7样本有变浑浊且出现不溶物的现象，测定后发现离子交换吸附过程中pH下降幅度大，导致部分蛋白变性失活[5]，因此洗脱液中蛋白浓度出现明显下降。综合考虑，选取吸附效率相对较高的弱碱型离子交换树脂D303和弱酸型离子交换树脂D151继续下一步实验。

从来都是听当妈的自说自话：“她长大了会感谢我的……”这是我第一次从一个孩子嘴里听到真诚的验证，这终于给一直纠结要不要当虎妈的我找到了一个理由。

3.3 树脂用量对右旋糖酐酶静态吸附效果的影响

以不同用量的D303和D151对右旋糖酐酶吸附4 h，吸附后用稀盐水进行洗脱，测定洗脱液各项参数见表2和表3。

从表2可知D303用量上升时，溶液pH也随之上升（酶液自身pH在5.5左右），但是右旋糖酐酶在中性偏碱性的环境下并不稳定[11]。

表2 离子交换树脂D303静态吸附右旋糖酐酶

表3 离子交换树脂D151静态吸附右旋糖酐酶

当D303加入量超过300 g/L时，pH上升幅度已影响了酶蛋白的稳定，洗脱液中可测得的蛋白浓度出现了下降，酶蛋白回收率也同样降低，证明已有酶蛋白变性失活。D151由于本身是弱酸性的离子交换树脂，随着用量的增多引起的pH变化并不大，依然维持偏弱酸的条件，有利于酶蛋白的稳定，因此D151、D303最佳用量分别为400、200 mg/mL。此外，洗脱液透明澄清，去除了原来大部分的色素以及有气味的杂质。

3.4 吸附时间对右旋糖酐酶静态吸附的影响

右旋糖酐酶酶液中加入200 mg/mL D303和400 mg/mL D151离子交换树脂进行静态吸附，在不同时间点取样测定上清剩余酶活变化趋势见图2。

图2 吸附时间对右旋糖酐酶静态吸附效率的影响

从图2可以观察到D151样本吸收的酶蛋白较D303多，而且在5 h时已经吸附了80%以上的酶蛋白，到24 h时，清液中的剩余酶活已经不足5%。同时，D303样本中剩余酶活还有50%以上，总体的吸附效率比D151要低。

3.5 洗脱盐溶液种类对静态洗脱效率的影响

以不同种类的盐溶液对D151树脂洗脱效果见表4。

表4 离子交换树脂D151静态吸附右旋糖酐酶

以不同浓度的盐溶液对已吸附了右旋糖酐酶的树脂进行洗脱，取样后计算出酶回收率，洗脱效果见图3。从表4中可以看到，硫酸镁和硫酸铵溶液并不能有效、专一地将目标酶蛋白洗脱，因此氯化钠溶液为最佳方案。

3.6 洗脱盐溶液浓度对洗脱效率的影响

图3 盐溶液浓度对洗脱效率的影响

从图3可以看到NaCl浓度超过200 g/L后，洗脱液中酶的回收率出现了下降。当使用饱和氯化钠溶液进行洗脱时，可以观察到洗脱液中少量沉淀出现。另外，考虑到后续脱盐操作，洗脱液的盐浓度不宜过高，定在最低的200 g/L浓度进行洗脱也是合适的。

3.7 洗脱时间对洗脱效果的影响

使用200 g/L浓度的NaCl溶液对吸附右旋糖酐酶后的树脂进行洗脱，按照时间点进行取样后，计算出酶回收率，结果如图4。

图4 吸附时间对右旋糖酐酶静态吸附效率的影响

如图4所示，洗脱时间的加长，对提高酶的回收率没有明显的帮助，因此静态洗脱条件控制在1 h为宜。

3.8 离子交换树脂动态洗脱纯化右旋糖酐酶

按照2.8步骤所述，收集24管样本后，测A280nm并记录，所得洗脱曲线如图5。

图5 离子交换树脂动态洗脱右旋糖酐酶

从图5中可以观察到，在第4、5、6管中存在一个大的吸收峰，在第13管中也存在一个小的吸收峰，经过酶活测定，只有第1个吸收峰有酶解反应，说明此吸收峰为目标峰。取第4管的样本进行SDS-PAGE电泳检测，结果为单一条带，分子量大致在66 KDa，与此前电泳结果相符（图6）。

总结前述实验步骤，以取100 mL右旋糖酐酶发酵液进行实验，初始酶活为10967.47 U/mL，比活力为8767.11 U/mg，经过硫酸铵沉淀，超滤膜脱盐以及树脂动态洗脱，回收率见表5。

4 结论

综上所述，D151大孔型离子交换树脂在纯化右旋糖酐酶上有明显效果，不仅体现在操作前后溶液中比活力的上升以及优秀的吸附性能，而且在除去发酵液中带来的异味和杂色也有相当好的效果。同时，本实验使用的工程菌株为组成型表达同时使用无机培养基进行培养，发酵液离心分离后即可获得酶蛋白较高的原始酶液，方便后续处理。存在的问题是常用于离子交换树脂洗脱的氯化钠溶液，不能完全把吸附在树脂的酶蛋白重新洗脱出来，静态吸附中回收率不到60%，动态吸附中则进一步降低。

图6 SDS-PAGE检测

表5 右旋糖酐酶的回收率

[1] 梁达奉. α-葡聚糖酶的基因工程菌构建、发酵及其应用研究[D]. 广州：广东工业大学，2011.

[2] 岑成福，蚁细苗，梁达奉，等. 酶解除去蔗汁中的右旋糖酐[J]. 甘蔗糖业，2013(6)：12-17.

[3] 钟志才，马步，徐杰荣，等. 葡聚糖酶应用于甘蔗制糖过程的试验研究[J]. 甘蔗糖业，2014(3)：41-46.

[4] 马步，常国炜，蚁细苗，等. 葡聚糖酶在原糖精炼生产中的应用研究[J]. 广西蔗糖，2014(3)：18-21.

[5] 黎志德，曾练强，蚁细苗，等. 右旋糖酐酶的保存稳定性研究[J]. 广西蔗糖，2013(4)：31-34.

[6] 张文会，王艳辉，马润宇. 离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶[J]. 食品工业科技，2003(6)：57-59.

[7] 俞宏峰，孙志浩，郑璞，等. 树脂吸附法制备固定化乳糖酶及其操作稳定性的研究[J]. 离子交换与吸附，2006，22(5)：423-428.

[8] 王晖. 吸附法分离发酵液中乳链菌肽的工艺研究[D].天津：河北工业大学，2007.

[9] CHEIGH C I, KOOK M C, KIM S B, et al. Simple one-step purification of nisin Z from unclarified culture broth of Lactococcus lactis subsp. lactis A164 using expanded bed ion exchange chromatography [J]. Biotechnology Letters, 2004(26): 1341-1345.

[10] 龚波林，任丽，阎超，等. 单分散亲水两性离子交换树脂的制备及其在生物大分子分离中的应用[J]. 高等学校化学学报，2007(5)：831-836.

[11] 黎志德. 右旋糖酐酶的纯化与表征[D]. 南宁：广西大学，2013.

[12] 赵亚华，高向阳. 生物化学与分子生物学实验技术教程[M]. 北京：高等教育出版社，2005.

(本篇责任编校：朱涤荃)

Separation and Purification of Dextranase with Macroporous Ion Exchange Resin

LI Zhi-de, CHANG Guo-wei, HUANG Zeng-wei, ZENG Lian-qiang, LIANG Da-feng
(Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316)

Dextranase from recombinant Pichia pastoris was separated and purified by macroporous ion exchange resin. Results show that dextranase can be absorbed by D151 effectively. Dextranase absorption rate is 53.51% after four hours of static adsorption, it will be 95% after twenty-four hours. D151 is able to separate dextranase and hybridprotein. Specific activity of dextranase is 2.43 times after dynamic elution purification, but the recovery rate of dextranase is only 8%.

Dextranase; Macroporous; Ion exchange resin; Dextranase

TS24

A

1005-9695(2015)04-0058-07

2015-06-16；

2015-08-01

八桂学者建设工程专项、现代农业产业技术体系建设专项经费资助

*通讯作者：梁达奉(1964-)，男，博士，教授级高级工程师，国家甘蔗产业技术体系岗位科学家，主要研究方向：制糖生物技术；

E-mail: ldfjt@126.com

黎志德，常国炜，黄曾慰，等. 大孔型离子交换树脂分离纯化右旋糖酐酶[J]. 甘蔗糖业，2015(4)：58-64.