反相高效液相色谱法测定克霉唑阴道片中克霉唑的含量

李荣华　李瑞明

反相高效液相色谱法测定克霉唑阴道片中克霉唑的含量

李荣华1李瑞明2

目的建立克霉唑阴道片中克霉唑含量的测定方法。方法采用高效液相色谱法，以HYPERSIL ODS C18柱（Φ4.6 mm×250.0 mm），粒度5 μm为分析柱，磷酸氢二钾溶液（取磷酸氢二钾4.35 g，加水溶解并稀释至1 000 ml）-甲醇（1:3）为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm。结果克霉唑在0.1～5.0 μg/ml范围内具有良好的线性关系。r=0.9999，平均回收率为99.0%。结论本测定方法简便，准确，可有效测定克霉唑阴道片中克霉唑的含量。

克霉唑；阴道片；含量测定；反相高效液相色谱法

克霉唑（Clotrimazole）作为广谱抗真菌药物之一，其对多种真菌有抑菌作用，特别是白色念珠菌抑制效果最佳。克霉唑药理作用主要通过抑制真菌细胞膜的合成，从而抑制真菌的代谢过程，浓度较高的克霉唑亦有直接杀菌作用。克霉唑阴道片由德国拜耳（Bayer）药厂开发并于20世纪90年代末在中国上市[1]。克霉唑在临床上主要用于真菌引起的外阴阴道炎、体癣、股癣等病症。克霉唑相关产品质量控制中主要通过非水滴定法进行含量测定[2-3]，本文对克霉唑阴道片采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行克霉唑含量测定，获得了满意的结果。

1　仪器与试药

高效液相色谱仪为日本岛津LC-10AT型，紫外检测器为日本岛津SPD-10A型，反相柱为大连依利特HYPERSIL ODS C18柱。对照品克霉唑购自中国药品生物制品检定所，批号：0129-2002，HPLC≥99.5%。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Φ4.6 mm×250.0 mm，粒度5 μm为分析柱，柱温采用室温；流动相：磷酸氢二钾溶液（取磷酸氢二钾4.35 g，加水溶解并稀释至1 000 ml）-甲醇（1:3）；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；丙酸睾酮与克霉唑之间的保留时间之比约为1.8，重复性试验RSD不得高于2.0%。

2.2溶液配制内标溶液制备：取丙酸睾酮对照品适量（约33 mg），置200 ml量瓶中，加流动相150 ml超声溶解约15 min，用流动相稀释至刻度，摇匀。供试品溶液制备：取本品10片，研细，混匀，精密称取适量（约相当于克霉唑100 mg），置100 ml量瓶中，精密加入内标溶液20 ml，加入流动相约70 ml，超声溶解约15 min，用流动相稀释至刻度，摇匀、过滤，即得。对照品溶液制备：取克霉唑对照品适量（约50 mg），精密称定，置于25 ml量瓶中，加流动相约15 ml。

2.3系统适应性试验取对照品溶液 20 μl，注入液相色谱中，记录色谱图，克霉唑tR约为12.3 min，丙酸睾酮tR约为20.0 min，克霉唑峰的理论塔板数为139 556，丙酸睾酮的理论塔板数为79 647（图1）。丙酸睾酮与克霉唑之间的保留时间之比为1.7。

图1　对照品溶液HPLC图

2.4阴性干扰试验依据克霉唑阴道片处方比例，取乳糖等，按“2.2”溶液配制方法，配制空白溶液，注入液相色谱中，获取阴性HPLC图谱。由HPLC图谱可知处方辅料不干扰克霉唑、丙酸睾酮的含量测定。结果见图2、3。

图2　空白辅料溶液HPLC图

图3　克霉唑阴道片样品溶液HPLC图

2.5线性关系考察克霉唑对照品溶液制成 2.05 mg/ml的溶液，精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，精密加入内标溶液2 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀。按本文色谱条件各进样20 μl测定，按外标法以对照品克霉唑面积（A）为纵坐标，对照品浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为：A=2.642C－8.321，r=0.9999（n=5）。结果表明，克霉唑进样量在0.1～5.0 μg/ml内线性关系良好。

2.6稳定性试验取同一批次克霉唑阴道片供试品溶液，按2.1项色谱条件于0、2、4、6、8 h分别进样20 μl测定，结果峰面积的RSD为0.63%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.7重复性试验分别平行配制同一批制剂室自制克霉唑阴道片（批号：120508）的供试品溶液 5份，按2.1项色谱条件下进样测定，克霉唑阴道片含量的RSD为0.76%，结果表明，该测定方法重复性良好。

2.8回收率试验精密称取对照品克霉唑（含量99.5%）80 mg、100 mg、120 mg，各平行3份（共9份），置100 ml量瓶中，按克霉唑阴道片处方比例加入混合均匀的辅料，同时精密加入内标溶液20 ml，加入流动相约70 ml，超声溶解约15 min，用流动相稀释至刻度，摇匀。按照2.5项下操作进行测定。按内标法以峰面积计算供试品中 C22H17ClN2的含量，计算回收率。结果表明，克霉唑阴道片含量测定方法回收率好，准确度较高，见表1。

表1　克霉唑回收率试验结果

2.9含量限度本品处方为每片含克霉唑为500 mg，参照USP 24版“Clotrimazole Vaginal Tablets（克霉唑阴道片）”的质量标准，将本品定为含克霉唑以（C16H19N3O5S）计应为标示量的93.0%～107.0%。

2.10含量测定取4个批次的克霉唑栓各10片，精密称定，置蒸发皿中，水浴上加热至熔化，冷却，不停搅拌使混合均匀，精密称取适量（约相当于克霉唑50 mg），置100 ml量瓶中，加甲醇适量，置50 ℃水浴中振摇使克霉唑溶解，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，置冰浴中放置2 h，立即滤过，取续滤液放至室温，作为供试品溶液，按本文色谱条件进样，见表2。

表2　克霉唑阴道片含量测定(以标示量计)结果(%)

3　讨论

通过对克霉唑阴道片的含量测定来进行质量控制，以流动相为空白，用克霉唑阴道片样品溶液和对照品溶液在240～300 nm扫描，结果克霉唑在254 nm波长处有最大吸收，因此选择254 nm为测定波长，与文献[4-5]报道一致。本文对采用不同组成和比例的流动相进行了比较，如甲醇-磷酸氢二钾溶液（pH 7.4，比例为3:1）、甲醇-0.1%磷酸（用三乙胺调pH 6.5，比例35:65）、如甲醇-磷酸氢二钾溶液（pH 7.4，比例为 2:1），结果表明，以甲醇-磷酸氢二钾溶液（pH 7.4，比例为3:1）为流动相显示效果最好。测量方法采用内标法，样品溶液中加入内标物丙酸睾酮，丙酸睾酮与克霉唑之间的保留时间之比为1.8，重复性试验RSD低于2.0%。采用丙酸睾酮作为内标物的测定结果表明，该方法可排除其他成分和溶液本身颜色的干扰，且操作简便、准确，可有效地控制克霉唑阴道片制剂的质量。

[1] 李青翠,田方,任瑞莉,等.HPLC法测定克霉唑栓的含量[J].药物分析杂志,2009,29(8):1364-1366.

[2] 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典(二部)[S].国家药典委员会,北京2000:276-277.

[3] 余进,黄毅岚,张丹,等.HPLC测定克霉唑阴道片的主药及有关物质[J].华西药学杂志,2007,22(4):443-445.

[4] 何丹,杨林.RP-HPLC法测定克霉唑乳膏的含量和有关物质[J].中国抗生素杂志,2011,36(4):285-287.

[5] 欧阳吉德,吴美香.高效液相色谱法测定克霉唑溶液中克霉唑的含量[J].中国医院药学杂志,2007,27(1):132-133.

Determination of Clotrimazole in Clotrimazole Virgin Tablets by RP-HPLC

Li RonghuaLi Ruiming

ObjectiveTo establish a method for determination of clotrimazole clotrimazole vaginal tablets content. MethodsUsing high performance liquid chromatography with ODS-C18column,HYPERSIL(phi 4.6 mm×250.0 mm), particle size of 5 mu m as analytical column,the solution of potassium hydrogen phosphate two(take two 4.35 G potassium hydrogen phosphate,dissolved in water and diluted to 1 000 ml)-methanol(1∶3)as mobile phase,the flow rate is 1 ml/min, the detection wavelength was 254 nm.ResultsClotrimazole in 0.1～5.0 μg/ml range has a good linear relationship. r=0.9999,the average recovery was 99.0%.ConclusionThis method was simple,accurate the content can effectively determine the Clotrimazole Vaginal Tablets in clotrimazole.

Clotrimazole;Virgin tablets;Quality determination;RP-HPLC

R927.2

A

1673-5846(2015)02-0012-03

1佛山市禅城区澜石医院，广东佛山528041

2中山大学附属第一医院药学部，广东广州510080

李荣华（1979.9-），本科学历，主管药师，药剂科主任。主要从事医院药学工作。E-mail：lironghua2003@163.com

李瑞明（1974-），本科学历，主管药师。研究方向：医院制剂。E-mail：liruiming321@163.com