壳聚糖和纳米SiOx处理对采后脐橙果实硬度的影响

吴雪莹，屈立武，周雅涵，曾凯芳,2,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.西南大学食品科学与工程国家级实验教学中心，重庆 400715）

壳聚糖和纳米SiOx处理对采后脐橙果实硬度的影响

吴雪莹1，屈立武1，周雅涵1，曾凯芳1,2,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.西南大学食品科学与工程国家级实验教学中心，重庆 400715）

探讨壳聚糖、纳米SiOx及两者复合处理对采后“Fengji”脐橙果实贮藏期间硬度的影响，同时，通过测定贮藏期间脐橙果皮中与细胞壁结构相关的物质含量及酶活性的变化，揭示壳聚糖、纳米SiOx及两者复合处理保持脐橙果实硬度的机制。结果表明，1.5%壳聚糖、0.08%纳米SiOx及两者复合处理能显著抑制脐橙果实贮藏期间硬度的降低，复合处理的效果最佳。3 种处理均能延缓脐橙果皮中原果胶降解，抑制可溶性果胶含量的上升，刺激纤维素和木质素的生成，降低果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶的活性。说明壳聚糖、SiOx及两者复合处理通过调控脐橙果皮细胞壁结构相关物质的合成与降解，抑制相关酶活性，强化了脐橙果皮细胞壁的强度，抑制了果实硬度的下降。

壳聚糖；SiOx；脐橙果实；硬度

脐橙果实表面光滑、色泽鲜艳、味道甘甜，是品质优良的柑橘品种，因其果顶部开裂成脐状，附有发育不完全的次生小果，故名为脐橙[1]。脐橙营养丰富，果肉含大量的胡萝卜素和维生素能有效抑制致癌物质的产生，减少心脏病的患病几率[2]。我国是世界上脐橙种植面积最大的国家，主要品种有赣南脐橙、纽荷尔脐橙、林娜脐橙、朋娜脐橙、华盛顿脐橙等。但是由于采后贮藏、运输和销售过程中的处理不当，一方面果实容易受到病原微生物的侵害，发生侵染性病害，引起果实腐烂变质；另一方面极易造成果实发生生理失调，营养损失，品质劣变[3]。贮藏过程中脐橙果实硬度是评价其品质的重要指标之一，与脐橙采后贮藏特性关系密切。脐橙果实硬度下降往往伴随着果肉软化，口感松散，果皮塌陷等情况，导致果实品质劣变，且不利于脐橙的包装和运输。果实硬度下降的主要原因是细胞壁结构及相关降解酶活性的变化[4]。果胶和纤维素是构成细胞壁的主要成分。果胶物质是由原果胶、可溶性果胶和果胶酸组成，原果胶含量的降低和可溶性果胶的生成造成果实硬度下降[5]。果实中的果胶甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）和纤维素酶是导致果实硬度下降主要的细胞壁降解酶[6-7]。

壳聚糖是由高等植物的细胞壁和藻类、菌类的细胞膜，以及蟹、虾、昆虫等的外壳通过脱乙酰化反应后得到的[8]，它是迄今为止发现的唯一的天然碱性氨基多糖，具有无毒性、生物降解性以及良好的生物相容性等特性[9]。壳聚糖涂膜处理不仅可以有效地控制枣果的青霉病[10]、葡萄的白腐病[11]等，还能抑制赣南脐橙[12]、草莓[13]、杏[14]等果蔬贮藏品质的降低，延长其贮藏期，提高商业价值。大量研究表明，壳聚糖涂膜处理可显著抑制果蔬硬度的下降以及调节相关酶活性，贾小丽等[15]发现壳聚糖涂膜可明显抑制冬枣的软化，Gao Pisheng等[16]的实验表明，壳聚糖处理明显延缓了葡萄贮藏过程中硬度的下降速度，Hong Keqian等[17]在番石榴上、Arnon等[18]在柑橘上、Ma Zengxin等[19]在桃上都得到了相同的研究结果。Liu Kaidong等[20]发现壳聚糖涂膜处理李果实后，PME和PG活性都明显小于对照组。Gol等[21]报道壳聚糖涂抹处理可抑制草莓贮藏过程中PME、PG和纤维素酶活性。但是由于壳聚糖本身的结构造成其溶解性不高，从而在使用过程中受到了一定的限制。

目前，越来越多的研究热点集中在壳聚糖涂膜材料中加入纳米材料，纳米材料的引入不但能解决壳聚糖溶解性低的问题，还能强化壳聚糖的贮藏保鲜的效果[22-23]。纳米SiOx是一种无味、无毒、无污染的白色粉末状非金属无机纳米材料，对果蔬采后贮藏过程中硬度的保持有一定的效果，如纳米SiOx处理可以显著抑制灵武长枣和金丝枣贮藏期间果实硬度的下降[24-25]。相关研究[26]表明，SiOx对壳聚糖具有修饰作用，能降低其透水率，改善其涂膜力学性能。Jen-Taut等[27]研究发现，壳聚糖与SiOx复合处理不仅可以维持壳聚糖本身的保鲜效果，还可以弥补壳聚糖在成膜过程中和实际应用中出现的热稳定性差、不易溶解等问题，可以有效地提高壳聚糖性能，扩大壳聚糖的应用范围。SiOx复合壳聚糖处理采后果蔬，可以显著提高猕猴桃[28]、龙眼[29]、草莓[30]、枣[31]等的贮藏品质。然而，有关壳聚糖复合SiOx处理对脐橙果实贮藏期硬度影响的研究尚未见报道。本实验拟研究壳聚糖、纳米SiOx单独处理以及壳聚糖复合SiOx处理对采后脐橙果实硬度的影响，同时通过测定果皮相关结构物质及关键酶活性，探究壳聚糖和纳米SiOx处理保持脐橙果实硬度的机制，从而为脐橙果实采后贮藏品质的保持提供可靠的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成熟的“Fengji”脐橙果实于2013年11月采摘自重庆市北碚区。选择无机械伤、未染病、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用2%次氯酸钠溶液浸泡1～2 min，自来水冲洗，并在室温（20～25 ℃）条件下晾干后备用。

壳聚糖（脱乙酸度不小于95%，黏度为120 cps） 山东奥康生物有限公司；纳米SiOx（平均粒径20～50 nm）浙江舟山明日材料科技股份有限公司；3,5-二硝基水杨酸 成都市科龙化工试剂厂；D-半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸 北京索莱宝生物技术有限公司；咔唑北京化学试剂公司；乙酰溴 常州市新华活性材料研究所；微晶纤维素 美国Sigma公司；蒽酮 上海科丰实业有限公司。其他试剂为实验室常用试剂。

1.2 仪器与设备

TA-XT2i物性测定仪 英国Stable Micro System公司；高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；紫外分光光度计 日本岛津公司；超低温冷冻储存箱 中科美菱低温科技有限公司；恒温贮藏箱 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 复合涂膜液的制备

取一定量纳米SiOx，加入适量的1%乙酸溶液，超声波处理10 min，使其均匀分散，再加入一定量的壳聚糖，不断搅拌1 h后再用超声波处理10 min，然后用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至5.6，静置24 h，制得1.5%壳聚糖与0.08% SiOx的复合溶液。

1.3.2 处理方法

将清洗后的“Fengji”脐橙果实随机分成4 组，分别在蒸馏水（对照）、1.5%壳聚糖、0.08% SiOx、1.5%壳聚糖和0.08% SiOx复合溶液中浸果1 min，取出自然晾干后单果包装，贮藏于4 ℃、80%～85%相对湿度的环境下，取样测定硬度相关指标。

1.3.3 果实硬度的测定

采用TA-XI2i质构仪测定果实硬度。果实置于P/50探头下做质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）实验，沿果实赤道等距离测定3 次。参数设置为：预压速率1.00 mm/s、下压速率0.5 mm/s、压后上行速率1.00 mm/s，两次压缩中间停顿5 s，试样受压变形5%，触发力值0.1 N。由质地特征曲线得到表征果皮硬度的评价参数。每个处理每次测定6 个果实，重复3 次。

1.3.4 原果胶与可溶性果胶含量的测定

参照Manganaris等[32]的方法，采用分光光度法测定果皮果胶含量，以D-（+）半乳糖醛酸为标样作标准曲线，以每克样品中生成半乳糖醛的含量作为原果胶或可溶性果胶的含量。

1.3.5 木质素含量的测定

参照Morrison[33]、刘尊英[34]等的方法并作适当修改。准确称取1.0 g柑橘果皮，加5 mL 95%乙醇研磨匀浆后经4 000 r/min离心10 min，沉淀物用3 mL 95%乙醇溶液和3 mL乙醇-正己烷（1∶2，V/V）冲洗3 次后105 ℃烘干。将干燥后的样品放入3 mL 25%溴乙酰冰醋酸溶液中，70 ℃恒温水浴中加塞保温反应30 min，加入0.9 mL 2 mol/L NaOH溶液终止反应，用冰醋酸定容10 mL，于4 000 r/min离心10 min后收集上清液作为被测样品。吸取0.1 mL上清液，加入4.9 mL蒸馏水（按1∶50稀释），以蒸馏水为调零，在280 nm波长处测定吸收度。以每克鲜样在280 nm波长处的吸收度表示木质素含量。

1.3.6 纤维素含量的测定

参照牛森[35]的方法，采用分光光度法测定纤维素含量，以纤维素为标样作标准曲线，按下式计算样品中纤维素含量：

式中：A为在标准曲线上查得的纤维素含量值/μg；B为样品鲜质量/g；C为样品稀释倍数；X为样品中纤维素含量/%。

1.3.7 PME与PG活性的测定

PG和PME活性测定参考Riov[36]、罗自生[37]等的方法。PG活性采用DNS比色法，以每小时每克鲜样37 ℃时分解果胶产生1 mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位（U）。PME活性采用pH计法，以30 min内释放出1 mmol/L的CH3O—定为一个酶活力单位（U）。

1.3.8 纤维素酶活性的测定

参照Grohmann等[38]的测定方法。以每小时每克鲜样37 ℃时分解纤维素产生1 μg葡萄糖为一个酶活力单位（U）。

1.4 数据分析

以上所有实验均重复3 次，并用Excel 2003统计分析数据，计算标准误差并制图；应用SPSS 21.0对数据进行方差分析，利用最小显著差异性检验、邓肯式多重比较进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖和纳米SiOx处理对脐橙果实贮藏期间硬度的影响

如图1所示，随着贮藏时间的延长，脐橙果实硬度不断减小，对照组果实硬度下降最明显，壳聚糖和SiOx单独处理组次之。与对照组和壳聚糖、SiOx单独处理组相比，壳聚糖复合SiOx处理能显著延缓脐橙果实硬度的降低（P＜0.05）。从贮藏第10天开始，壳聚糖复合SiOx处理组和对照组、单独处理组之间存在显著性差异（P＜0.05）。贮藏第10天时，对照组、壳聚糖处理组和SiOx处理组硬度分别是壳聚糖复合SiOx处理组硬度的88.1%、93.8%和92.7%。至贮藏第60天时，对照组、壳聚糖、SiOx单独处理组硬度分别是壳聚糖复合SiOx处理组硬度的77.5%、86.1%和91.6%。

图 1 壳聚糖和SiOx处理对脐橙果实硬度的影响Fig.1 Effects of chitosan and SiOxcoating on fi rmness of navel orange

2.2 壳聚糖和纳米SiOx处理对脐橙果皮果胶含量的影响

图 2 壳聚糖和SiOx处理对脐橙果皮原果胶含量的影响Fig.2 Effects of chitosan and SiOxcoating on protopectin content of navel orange peel

如图2所示，贮藏过程中脐橙果皮原果胶含量呈现先降低后升高的趋势。在整个贮藏期间，对照组果实的原果胶含量始终处于较低的水平，壳聚糖复合SiOx处理能够显著延缓果实原果胶的降解，这对于脐橙果实硬度的保持具有积极的意义。贮藏第40天时，对照组的原果胶含量下降至最低水平，此时，壳聚糖、SiOx及复合处理组果实的原果胶含量分别为对照组果实的130.7%、118.3%和124.8%（P＜0.05）。

图 3 壳聚糖和SiOx处理对脐橙果皮可溶性果胶含量的影响Fig.3 Effects of chitosan and SSiiOOxcoating on water-soluble pectin content of navel orange peel

如图3所示，各处理组脐橙果皮的可溶性果胶含量呈现逐渐上升的趋势。贮藏至30 d时，对照组果实可溶性果胶含量为壳聚糖、SiOx单独处理组和壳聚糖复合SiOx处理组的1.12、1.17 倍和1.26 倍。整个贮藏周期中，对照组果皮可溶性果胶含量最高，壳聚糖和SiOx单独处理次之，壳聚糖复合SiOx处理组最低。

2.3 壳聚糖和纳米SiOx处理对脐橙果皮纤维素和木质素含量的影响

图 4 壳聚糖和SiOx和处理对脐橙果皮纤维素含量的影响Fig.4 Effects of chitosan and SiOxcoating on cellulose content of navel orange peel

如图4所示，脐橙果皮的纤维素含量总体呈现波浪形变化趋势。贮藏40 d以前，对照组果皮的纤维素含量低于处理组，其中贮藏至30 d时，差异性最大（P＜0.05）。壳聚糖、SiOx单独处理和复合处理组的纤维素含量分别是对照组的1.24、1.22 倍和1.34 倍。贮藏40 d后，壳聚糖和SiOx处理对脐橙果皮纤维素含量变化的影响减弱。

图 5 壳聚糖和SiOx处理对脐橙果皮木质素含量的影响Fig.5 Effects of chitosan and SiOxcoating on lignin content of navel orange peel

由图5可知，脐橙果实贮藏过程中，对照组的木质素含量无显著性变化，壳聚糖、SiOx单独处理及两者复合处理显著提高了果皮木质素的含量（P＜0.05），有助于脐橙果实贮藏期间硬度的保持。贮藏至20 d时，壳聚糖、SiOx单独处理组和复合处理组的木质素含量是对照组的121.0%、120.9%和129.6%。贮藏至60 d时，壳聚糖、SiOx复合组的木质素含量达到最大值，此时壳聚糖、SiOx单独处理和复合处理组的木质素含量分别是对照组的116.2%、121.4%和127.0%。

2.4 壳聚糖和纳米SiOx处理对脐橙果皮PME与PG活性的影响

图 6 壳聚糖和SiOx处理对脐橙果皮PME活性的影响Fig.6 Effects of chitosan and SiOxcoating on pectin methylesterase activity of navel orange peel

如图6所示，贮藏期间脐橙果皮的PME活性呈先上升后下降的趋势。对照组果实PME活性一直处于较高的水平，在贮藏第40天达到最大值。贮藏至40 d时，壳聚糖单独处理组和壳聚糖、SiOx复合处理组果皮的PME活性与对照组相比差异显著（P＜0.05），分别为对照组的77.0%和80.4%，SiOx单独处理组果皮的PME活性与对照组之间无显著性差异。

图 7 壳聚糖和SiOx处理对和脐橙果皮PG酶活性的影响Fig.7 Effects of chitosan and SiOxcoating on polygalacturonase activity of navel orange peel

整个贮藏期间脐橙果皮PG活性呈上升趋势（图7）。壳聚糖、SiOx单独处理及两者复合处理能抑制脐橙果皮中PG活性的增加，在贮藏后期效果更为显著（P＜0.05）。贮藏至50 d时，对照组果皮PG活性较高，壳聚糖、SiOx单独处理组及两者复合处理组果皮的PG活性与对照组之间有显著性差异（P＜0.05），分别为对照组的85.0%、82.5%和77.5%。贮藏至60 d时，壳聚糖、SiOx单独处理组及两者复合处理组果皮的PG活性分别为对照组的78.9%、77.4%和82.2%。

2.5 壳聚糖和纳米SiOx处理对脐橙果皮纤维素酶活性的影响

如图8所示，整个贮藏期间，脐橙果皮的纤维素酶活性呈现上升的趋势。壳聚糖，SiOx单独处理及两者复合处理能抑制脐橙果皮中纤维素酶活性的上升。贮藏第10天时，对照组果皮纤维素酶活性分别为壳聚糖、SiOx单独处理及两者复合处理组的1.28、1.45 倍和1.50 倍；贮藏至50 d时，壳聚糖，SiOx单独处理组及两者复合处理组果皮的纤维素酶与对照组之间有极显著性差异（P＜0.01），对照组的纤维素酶活性分别为壳聚糖、SiOx单独处理组和复合处理组的1.45、1.35 倍和1.23 倍。

图 8 壳聚糖和SiOx和复合处理对和脐橙果皮纤维素酶活性的影响Fig.8 Effects of chitosan and SiOxcoating on cellulase activity of navel orange peel

3 结论与讨论

本实验的研究结果表明，1.5%壳聚糖、0.08%纳米SiOx单独处理及两者复合处理能有效抑制贮藏过程中“Fengji”脐橙果实硬度的下降，1.5%壳聚糖、0.08%纳米SiOx复合处理效果最显著。1.5%壳聚糖、0.08% SiOx单独处理及两者复合处理通过抑制“Fengji”脐橙果皮中PG、PME和纤维素酶的活性，从而延缓原果胶的降解，抑制可溶性果胶的生成，刺激纤维素和木质素的合成与累积，进而强化了果皮细胞壁结构，延缓了脐橙果实软化。

脐橙果实采后贮藏期间发生一系列的生理生化反应，其中较为明显的特征即为果实硬度的下降，而果实硬度作为果实品质构成要素之一，与脐橙采后贮藏特性密切相关。本实验中壳聚糖和纳米SiOx单独处理及两者复合处理都能有效地保持“Fengji”脐橙果实的硬度，这与大多数研究结果相似[15,24-26]。果胶和纤维素作为果实细胞壁的主要成分，对脐橙果实硬度的影响起到关键性作用。果胶物质中原果胶的降解和可溶性果胶的生成都会导致果实硬度下降。本实验发现“Fengji”脐橙果实原果胶含量在贮藏第40天时处于最低点，整个贮藏过程中壳聚糖和纳米SiOx单独处理及两者复合处理都能抑制脐橙果实原果胶含量的降低和可溶性果胶的升高，这在保持果实硬度上有一定的积极意义。纤维素作为脐橙果实细胞壁的主要组成成分，能够有效地保持果实硬度，从贮藏过程中的整体趋势可以得出壳聚糖和纳米SiOx单独处理及两者复合处理对“Fengji”脐橙果实纤维素含量有维持作用。木质素是果实次生代谢产物，是构成细胞壁次生结构的主要成分，木质素的合成与积累可以强化果皮细胞结构，延缓果实软化。整个贮藏期间，脐橙果实木质素含量明显增加，且经过壳聚糖和纳米SiOx单独处理及两者复合处理的脐橙果实木质素含量的增加幅度大于对照组。PME、PG和纤维素酶等降解酶导致脐橙果实细胞壁降解并且减少细胞之间的相互连接，造成细胞离散，从而引起果实软化。本实验发现对照组脐橙果实的PME、PG和纤维素酶活性显著高于经过壳聚糖和纳米SiOx单独处理及两者复合处理的脐橙果实，这对果实硬度的保持是不利的，此结果与大多数研究[20-21]相似。

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Effects of Chitosan and SiOxTreatments on Firmness of Postharvest Navel Orange Fruits

WU Xueying1, QU Liwu1, ZHOU Yahan1, ZENG Kaifang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The aim of this study was to investigate the effects of chitosan, SiOxand their combination on the fi rmness of“Fengji” navel orange fruit during storage. The mechanism involved was explored by measuring the contents of compounds and the enzyme activities related to the cell wall structure in peels. The results indicated that 1.5% chitosan and/or 0.08% SiOxcould signifi cantly delay the decrease of orange fruit fi rmness during storage. Meanwhile, the best effect was achieved by the combined treatment. All three treatments could delay the degradation of pectin, suppress the increase of soluble pectin, increase the contents of cellulose and lignin, and inhibit the activities of pectin methylesterase (PME), polygalacturonase (PG) and cellulase. In conclusion, both the individual and combined treatments can reinforce the strength of peel cell wall, inhibit the decrease of fruit fi rmness and maintain fruit quality by regulating the synthesis and degradation of cell wall structural materials and inhibiting related enzyme activities.

chitosan; SiOx; nav el orange fruit; fi rmness

S609.3；S667.7

A

1002-6630（2015）02-0204-06

10.7506/spkx1002-6630-201502040

2014-08-04

国家自然科学基金面上项目（31271958）；重庆市科技攻关（应用技术研发类/重点）项目（cstc2012gg-yyjsB80003）；

国家公益性行业（农业）科研专项（201203034）

吴雪莹（1989—），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏工程。E-mail：wuxueyingtvb@163.com

*通信作者：曾凯芳（1972—），女，教授，博士，研究方向为农产品加工与贮藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com