泰安地区冷鲜猪肉中沙门氏菌污染情况调查

郝 心（山东农业大学食品科学与工程学院 山东 泰安 271018）陈正涛王方昆王淑静*（山东农业大学动物科技学院）

调查报告

泰安地区冷鲜猪肉中沙门氏菌污染情况调查

郝 心①（①山东农业大学食品科学与工程学院 山东 泰安 271018）陈正涛②王方昆②王淑静②*（②山东农业大学动物科技学院）

近年来食品安全问题倍受关注，其中因微生物污染造成的食源性疾病是是世界食品安全中较为突出的问题。沙门氏菌是肠杆菌科中一大类重要的人畜共患致病菌，是引起食源性细菌感染的最重要病原。病因主要是摄入污染沙门氏菌而未煮熟的食品或饮料等，而带菌的畜禽肉胴体，奶制品以及其它畜禽产品是污染的重要来源。农贸市场及超市成为城乡居民获得生鲜猪肉的主要来源，其猪肉卫生质量同每位消费者的健康息息相关。本研究针对泰安市农贸市场以及大型超市中的冷鲜肉沙门氏菌污染情况进行了检测，其中针对3个大型超市和4个农贸市场的28家生鲜猪肉销售点218份样品进行采集分析，结果表明，泰安市生鲜猪肉中存在不同程度的污染，沙门氏菌的总检出率为13.3%。其中，超市中检出率为9.21%，农贸市场中检出率为15.94%。

沙门氏菌病是一种重要的人畜共患病。1885年Salmon首次从患猪霍乱的病料中分离到猪霍乱杆菌。沙门氏菌广泛分布于自然界，是肠杆菌科中一类重要的人畜共患、革兰氏阴性病原菌。沙门氏菌在细菌性食物中毒中为发病率最高的一种。2003年曾晓芳调查结果显示，我国细菌性中毒中有70%～80%是由沙门氏菌引起的[1]。沙门氏菌在自然界具有广泛的宿主，少数如马流产、羊流产、牛流产沙门氏菌，猪伤寒沙门氏菌等对宿主有选择性外，大部分血清型的沙门氏菌属于非适应性或泛嗜性沙门氏菌，具有广泛的宿主谱，能够引起各种动物包括人在内的沙门氏菌病[2]。沙门氏菌作为病原菌对人畜健康和食品安全造成巨大的危害，给养殖业造成巨大的损失，同时给人类带来很多安全隐患以及健康方面的问题。沙门氏菌作为食品检测中的一个重要指标在畜牧兽医、公共卫生、食品卫生等都具有非常重要的意义。随着科学技术的发展，尤其是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，催生出了快速、简便、准确、成本低的沙门氏菌检测方法，从以传统方法为基础的检测手段发展为以DNA为基础或以免疫学为基础的检测方法，并在实践检验中不断创新。常规的标准检测方法比较准确，但费时费力，至少3d才能得到初步结果[3,4]。1977年Kryinski和Heimsch首次将ELISA方法应用在食品沙门氏菌的检测，目前该法已经广泛用于沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌等有害生物的检测。此法缺点易造成结果假阳性或假阴性；优点是该法检测限较高，可以达到106cfu/ml[5]。其中还包括 噬菌体法[6,7]。我国科学家何晓青等人发现了一种作为肠杆菌科分属诊断噬菌体，随后科学家对该法进行了大量研究[8-10]。此外，还可以对噬菌体进行荧光标记来检测沙门氏菌。Kazuhiko等[11]用荧光标记的T4噬菌体来检测污水中大肠杆菌的含量。Ramji S. Lakshmanan等[12]利用噬菌体固定化磁致弹性传感器技术检测鼠伤寒沙门氏菌。聚合酶链式反应是美国科学家Mullis于1985年发明的一种体外扩增特定基因或DNA的方法；基于其具有快速、准确、高效等优点，PCR技术广泛用于食品中有害微生物的检测[13]。目前用于沙门氏菌检测的引物主要分为三大类[14]：属特异基因引物、血清群特异基因引物和血清型特异基因引物。

本研究拟应用PCR技术，扩增FimY基因的属特异基因引物设计引物，对泰安市大中型超市以及农贸市场中冷鲜猪肉中的沙门氏菌的污染情况进行调查。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鼠伤寒沙门氏菌阳性菌株：由本实验室保存。Taqplus DNA酶，dNTP，DEPC水购自北京全式金生物科技有限公司。凝胶成像系统、PCR仪购自美国Bio-Rad公司；电泳仪购自北京六一仪器公司；高压灭菌锅购自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 自泰安市各超市及农贸市场采集新鲜猪肉若干份，保存于冰盒中于当日送回实验室4℃保存。

1.2.2 样品处理 按照GB4789.4-2010的方法进行直接增菌，称取25g样品放入盛有225ml BPW的无菌均质杯中，以8000～10000r/min均质1～2min。用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2，无菌操作将样品转至500ml无菌锥形瓶中，于37℃培养12h。

1.2.3 DNA的提取 取1.5ml上述培养混合菌液，12000rpm离心2min后用530μl TE重悬，加入30μl的10% SDS和60μl的1mg/ml蛋白酶K，混匀后37℃水浴1h；取出

再加入100μl的5mol/L NaCl溶液和80μl的CTAB/NaCl，65℃水浴10min，取出降至室温后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇体积比为25:24:1混合液，混匀12000rpm离心10min；吸取上清加入等体积的氯仿∶异戊醇体积比为24:1混合液，混匀12000rpm离心10min；取上清加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃静置20min，12000rpm离心10min，用70%乙醇洗涤2次，室温干燥后加入20μl pH8.0的TE溶解备用。

1.2.4 PCR扩增 根据文献报道[15]设计FimY基因的PCR扩增引物，以提取上述菌落全基因组为模板，进行PCR扩增。

表1 Fimy基因PCR扩增引物

PCR反应体系为：模板DNA 1μl、10×buffer(不含Mg2+)5μl，25mmol/l MgCl23μl，dNTP (0.2mmol/L of each) 3μl，上下游引物各1μl，Taq DNA Polymerase 0.5μl，用灭菌去离子水补足至50μl，混匀离心10s。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。参考《分子克隆实验指南》的方法，对PCR产物进行凝胶电泳，凝胶成像仪观测扩增结果。

2 结果与分析

2.1 样本的采集

分别从泰安市内3个超市和4个农贸市场进行样本采集。分别从三个超市中随机抽取三家生鲜猪肉销售点，每个销售点随机采取8～9分样品；分别从4个农贸市场随机抽取四家生鲜猪肉销售点，随机采样与超市中采样相同。

2.2 PCR检测

将增菌后的菌液按碱裂解法抽提DNA，以抽提的DNA为模板，分别以Fimy1和Fimy2为引物急性PCR扩增，结果如图1、2。

图1 超市猪肉沙门氏菌检测结果M：DNA Marker；1-8/9：沙门氏菌PCR检测结果

图2 农贸市场猪肉沙门氏菌检测结果M：DNA Marker； M：DNA Marker； 1-8/9：沙门氏菌PCR检测结果；10：阴性对照

2.3 样本检出率统计结果

见表2。

表2 检出率统计结果

3 讨论

现阶段，沙门氏菌的检测方法主要有传统标准法、PCR法和免疫有关的检测手段。传统检测方法存在着费时、操作繁琐等诸多缺点，很难应对大规模沙门氏菌的快速检测；免疫学方法虽然可以得到相对准确的结果，但其成本高、灵敏度较低；相比较而言，PCR法具有灵敏、快速、准确的优点，适合大样本的调查。本研究采用传统法分离与PCR法鉴定相结合的方式，实现了快速准确的从大批量样本中对沙门氏菌的分离并鉴定的目的。调查结果显示，泰安市猪肉中沙门氏菌的检出率比较高，总的沙门氏菌的检出率为13.3%；其中来自农贸市场的猪肉样品沙门氏菌的检出率和超市的猪肉样品沙门氏菌检出率分别为15.49%和9.21%，相比之下超市猪肉中沙门氏菌的污染要轻与农贸市场，这可能是由于运输途径，搬运、装载过程中处理方式以及储存环境不同造成的；无论是超市还是农贸市场，浅层肉中沙门氏菌的检出率要明显高于深层肌肉，如本研究超市中浅层比深层高12.22个百分点，农贸市场中浅层比深层高5.45个百分点。这说明大部分的污染都是外源的，其中屠宰、加工、运输以及储藏等过程中存在很大的风险。

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S852.61+2

A

1007-1733(2015)09-0060-03

2015–08–10）

泰安市大学生科技创新计划项目资助(2014DD004)

*通讯作者