沟眶象体内感染的Wolbachia 的wsp 基因克隆与序列分析

高 朋，刘振凯，温俊宝

(北京林业大学林木有害生物防治北京市重点实验室，北京 100083)

Wolbachia 是广泛分布于昆虫细胞内的一类细胞内共生菌(Werren et al.，2008)。在16%的昆虫体内检测到Wolbachia 的存在，其中包括鞘翅目、双翅目、半翅目、鳞翅目、直翅目及膜翅目(Werren et al.，1995;West et al.，1998)。通过长PCR 扩增检测发现76%的节肢动物感染Wolbachia(Jeyaprakash et al.，2000)。说明Wolbachia 可能是现已发现的共生细菌中感染寄主最为丰富的类群。Wolbachia 对寄主昆虫的主要影响有孤雌生殖、细胞质不亲和、雌性化、杀雄作用。基于Wolbachia的对寄主昆虫的这些影响，国内外开展了大量相关研究，主要集中在分类地位(van Meer et al.，1999;Jeyaprakash et al.，2000)，感染率(冯宏祖等，2014)，生殖调 控 (陆明红，2011)，Wolbachia 的多重感染(李菁等，2010)等方面。

目前对于Wolbachia 的系统发育分析主要通过wsp、ftsZ、16S rDNA、gltA、groEL 等基因进行。Wolbachia 的系统发育分析早期主要通过16S rDNA基因进行，并对Wolbachia 进行分类，随后的研究表明16S rDNA 基因的进化速度比较慢，不适用于Wolbachia 的多样性进行精细的分类研究(Stouthmaer et al.，1993)。逐渐采 ftsZ 对Wolbachia 进行系统发育研究，因为其进化较快(Schilhutizen et al.，1998)。基于ftsZ 的系统发育研究，Wolbachia 可分为A-F 的6 个组 (Lo et al.，2002)。昆虫感染的Wolbachia 主要属于A 组和B 组，并通过wsp 基因将A 组和B 组进行了细分。Zhou 等 (1998)认为A 组包括Mel、AlbA、Riv、Mors、Uni、Pap、Haw 和Aus 8 个亚群，B 组包括Dei、Con、Pip 和CauB 4 个亚群。通过进一步 究 van Meer 等 (1999) 和Jeyaprakash 等(2000)将A、B 群进进一步细分为10 亚群、11 亚群。

沟眶象Eucryptorrhynchus chinensis (Olivier)主要危害臭椿树Ailanthus altissima (Mill.)及其变种千头椿Ailanthus altissima var.qiantouchun (杨贵军等，2008)。在中国北方城市臭椿树作为常用的行道树，伴随着种植面积的扩大，近年来沟眶象的危害越来越严重。目前对沟眶象的生物学特性和生理生化等方面已经进行了较多研究(雍惠莉等，2007;杨贵军等，2008)。沟眶象幼虫主要在地面以下活动，危害臭椿的根部，化学防治存在一定困难(于倩倩等，2012)。Wolbachia 能调控昆虫的生殖，对沟眶象的防治可能存在一定帮助。目前尚无有关沟眶象体内Wolbachia 的报道。本文对沟眶象是否感染 Wolbachia;如果感染Wolbachia，对感染的Wolbachia 的分类地位，通过wsp 基因进行判断和分析，为进一步研究Wolbachia对沟眶象生殖的调控提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

沟眶象分别采集于宁夏灵武、中宁、中卫，山东聊城，安徽淮北。所有样本均用95%酒精保存，置于-20℃待用。

1.2 试剂

基因组DNA 提取试剂盒，琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒，DNA 克隆试剂盒及PCR 所用的各种试剂均购自天根生化科技(北京)有限公司。试验中所使用引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.3 沟眶象DNA 总提

分别采用单头相应试虫，利用基因组DNA 提取试剂盒，按照试剂盒加入GA 缓冲液充分研磨，使昆虫组织破碎，配置成细胞悬浮液，提取试验用虫的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的完整性。将DNA 模板置于-20℃冰箱中保存备用。

1.4 沟眶象体内的Wolbachia 的wsp 基因的扩增

扩增使用Wolbachia 的wsp 基因片段的通用引物81F (5'-TGGTCCAATAAGTGAT GAAGAAAC-3')和691R (5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3')(Zhou 等，1998)。PCR 反应体系体积为25 μL，其中2×Power Taq PCR MasterMix (北京天)12.5 μL，DNA 模板1 μL，10 nmol/L 上下游引物各1 μL，灭菌水9.5 μL。PCR 扩增条件为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s，48℃退火45 s，72℃延伸45 s，35 个循环;最后72℃总延伸10 min。使用1%琼脂糖凝胶检测PCR 扩增产物。

1.5 序列测定与分析

将目的基因wsp 片段的PCR 产物回收、纯化，然后与pGM-T 载体连接，再转化到感受态大肠杆菌TOP-10 菌株中，筛选阳性克隆，随机挑选3 个克隆，委托北京擎科生物技术有限公司进行双向测序。每个种群随机选取20 个个体对其体内的Wolbachia 进行检测，然后对wsp 基因进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 总提DNA 的检测

沟眶象的总提DNA 通过1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000 进行检测，DNA 条带清晰，无拖尾弥散现象，OD260/OD280均在1.8 左右。表明DNA 纯度较高，可用克隆与检测。

2.2 沟眶象体内Wolbachia 的感染情况

通过使用Wolbachia 的wsp 基因通用引物对5 个种群的个体的腹部总提NDA 进行扩增检测，结果发现每个种群每个个体都都扩增出一条593 bp 的片段，证实了沟眶象每个种群都感染了Wolbachia，而且感染率为100% (表1)。

表1 沟眶象5 个地理种群的Wolbachia 检测Table 1 Wolbachia infection of five populations of Eucryptorrhynchus chinensis

2.3 沟眶象体内Wolbachia 的wsp 基因序列分析

根据克隆测序结果得知，扩增出的片段大小为593 bp，各种碱基含量:190T (32.0%)、90C(15.2%)、180A (30.4%)、133G (22.4)。获得序列A+T 的含量为62.4%，A +T 含量明显高于G+C 含量(37.6%)，与其它昆虫相似。将获得基因在NCBI 上进行比对，与其他Wolbachia 的wsp基因同源性很高，确定为wsp 基因。该基因序列已提交到GenBank (登录号为KP713759)。

2.4 沟眶象体内Wolbachia 的wsp 基因的同源性分析

Wsp 同源性分析主要参照A.Jeyaprakash 在2000年提出的A、B 群分类方法，其中A 群分为10 个亚群，B 群分为11 亚群。从NCBI 中下载van Meer 等(1999)和Jeyaprakash 等(2000)分类中所用的38 条Wolbachia 的wsp 基因序列片段(表2)，及本文获得沟眶象体内的wsp 基因片段，使用MEGA 6.0 建立了NJ 系统发育树，其中各分支的置信度用1000 次自导复制来评价。根据wsp 基因同源性，通过NJ 系统发育树分析，得出沟眶象体内的Wolbachia 属于A 群Dro 亚群(图1)。沟眶象体内的Wolbachia 与同属Dro 亚群的Trichopria drosophilae 体内的Wolbachia 菌株在61、64、68、81、363 处有碱基A 和碱基C 的置换，在117、132、150、159 处有碱基T 和碱基C 的置换，在67、84、85、168 有碱基A 和碱基G 的置换，在70 处有碱基A 和碱基T 的置换，在153 有碱基A和碱基G 的置换，在346 处有碱基C 和碱基G 的置换。

表2 用于构建Wolbachia 系发育统树的wsp 基因序列信息Table 2 The information of wsp gene for contracting the phylogenetic tree of Wolbachia strains

(续上表)

图1 沟眶象感染的Wolbachia 的分类地位Fig.1 The classification status of Wolbachia infection Eucryptorrhynchus chinensis

3 结论与讨论

本文对沟眶象的5 个地理种群进行了随机抽样检测，发现5 个地理种群的感染率均为100%。相关的报道中，也曾出现昆虫的一些地理种群Wolbachia 感染达到100%的情况，但很少出现多个地理种群感染率均100%的情况，一般各个地理种群间都存在一定的差别(冯宏祖等，2014)。本文检测的所有个体均受到Wolbachia 感染，推测Wolbachia 对沟眶象的感染率100%。但本文所采样本及地理种群数较少，要证实推测需要增加地理种群数和样本量。

Wolbachia 存在水平传播的现象，其中一种是Wolbachia 在昆虫与其他节肢动物间的水平传播。沟眶象的Wolbachia 感染率高达100%，有可能是寄生在臭椿树的其他节肢动物水平传播所致，而且对臭椿树上的另一种害虫臭椿沟眶象也进行了检测，检测到其体内有相同的 wsp 基因的Wolbachia 菌株。Wolbachia 是否在二者之间发生了水平传播，需要进一步证明。

本文获得的沟眶象感染的Wolbachia 的wsp 基因片段长度为593 bp。与先前的报道中同样使用wsp 通用引物(81F、691R)进行PCR 扩增后获得片段长度存在差异。蝶蛹金小蜂 Pteromalus puparum 感染的Wolbachia 通过通用引物PCR 扩增后wsp 基因大小为540 bp (王欢等，2006)，苹果蠹Cydia pomonella 蛾感染的Wolbachia 在PCR 扩增后获得wsp 基因片段大小为617 bp (冯宏祖等，2014)。而本文获得wsp 基因片段为593 bp，长度居中。沟眶象感染的Wolbachia 的wsp 基因片段与同属 Dro 亚群的 Trichopria drosophilae 体内的Wolbachia 菌株长度相同，与其它亚群的wsp 基因长度存在较大差异。

调控寄主的生殖是Wolbachia 的一个重要作用，主要包括诱导雌性化、胞质不亲和(CI)、诱导孤雌生殖、杀雄作用等。由于沟眶象幼虫主要在臭椿根部取食，一般药物防治很难达到效果。沟眶象体内Wolbachia 的感染率100%，目前其体内只检测到1种Wolbachia。这种Wolbachia 属于A 群Dro 亚群。同为Dro 亚群Trichopria drosophilae感染的Wolbachia 对寄主具有诱导CI 的能力(van Meer，1999)，据此推测沟眶象体内的Wolbachia也可能诱导CI 的作用。如果能利用其诱导沟眶象CI，可以作为一种有效的生物防治手段。

本文通过wsp 基因只检测到1种Wolbachia，如果采用基于多个基因位点的MLST 分类系统(MultilocusSequence Typing System)可能会发现更多的Wolbachia 菌株，但MLST 的亚型分类尚不完善(李菁等，2010)。随着技术的发展，使用MLST 分类系统在沟眶象体内可能会发现新的Wolbachia 菌株。

References)

Feng HZ，Wang YP，Cao Y，et al.Cloning and sequence analysis of the Wolbachia wsp gene to decect Wolbachia of in Cydia pomonella［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2014，51 (3):725-732.［冯宏祖，王月萍，曹玉，等.苹果蠹蛾体内Wolbachia 的wsp基因克隆与序列分析［J］.应用昆虫学报，2014，51 (3):725-732］

Hilgenboecker K，Hammerstein P，Schlattmann P，et al.How many species areinfected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data［J］.FEMS Microbiol.Lett.，2008，281 (2):215-220.

Jeyaprakash A，Hoy MA.Long PCR improves Wolbachia DNA amplification:wsp sequences found in 76% of sixty-three arthropod species［J］.Insect Molecular Biology，2000，9 (4):393-405.

Lu MH，Xie RR，Zhao ZJ，et al.A comparative study of factors influencing the expression of Wolbachia induced cytoplasmic incompatibility in two populations of the two-spotted spider mite，Tetranychus urticae Koch［J］.Acta Entomologica Sinica，2011，54 (9):1018-1026.［陆明红，谢蓉蓉，赵臻君，等.二斑叶螨两种群中Wolbachia 诱导的胞质不亲和作用的影响因子比较研究［J］.昆虫学报，2011，54 (9):1018-1026］

LI J，Zhang Y，Wang ZY，et al.Wolbachia infection in four geographic populations of yellow peach moth，Conogethes punctiferalis in China［J］.Journal of Environmental Entomology，2010，32 (3):322-328.［李菁，张颖，王振营，等.我国桃蛀螟四个地理种群感染Wolbachia 的研究［J］.环境昆虫学报，2010，32 (3):322-328］

Schilthuizen M，Honda J.Parthenogenesis-Inducing Wolbachia in Trichogramma kaykai(Hymenoptera:Trichogrammatidae)originates from a single infection［J］.Ecology and Population Biology，1998，91 (4):410-414.

Stohutamer R.Wolbachia Induced Parthenogenesis ［M］.New York:Oxford University Press，1997，102-124.

Yang GJ，Tong HL，Wang XP.The biological characters and behavior of Eucryptorrhynchus chinensis［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2008，45 (1):65-69.［杨贵军，雍惠莉，王新谱.沟眶象的生物学特性及行为观察［J］.昆虫知识，2008，45 (1):65-69］

Yu QQ，Chen C，Liu ZK，et al.Occurrence and life-history of Eucryptorrhynchus chinensis in Lingwu，Ningxia ［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2012，49 (4):1005-1009.［于倩倩，陈冲，刘振凯，等.宁夏灵武市沟眶象发生特点［J］.应用昆虫学报，2012，49 (4):1005-1009］

Yong HL，Yang GJ，Yu YZ，et al.Studies of characters of cellulase in Eucryptorrhynchus chinenis (Olivier)［J］.Journal of Agricultural Sciences，2007，28 (4):16-19.［雍惠莉，杨贵军，于有志，等.沟眶象纤维素酶性质的研究［J］.农业科学研究，2007，28 (4):16-19］

van Meer M，Witteveldt J，Stouthamer R.Phylogeny of the arthropod endosymbiont Wolbachia based on the wsp gene ［J］.Insect Molecular Biology，1999，8 (3):399-408.

Wang H，Li K，Liu H，et al.Molecular detection and sequence analysis of wsp gene from Wolbachia in two species of pteromalids，Pteromalus puparum and Nasonia vitripennis (Hymenoptera:Pteromalidae)［J］.Acta Phytophylacica Sinica，2006，33 (3):235-240.［王欢，李凯，刘怀，等.两种金小蜂体内Wolbachia的wsp 基因分子检测及序列分析［J］.植物保护学报，2006，33 (3):235-240］

Werren JH，Baldo L，Clark ME.Wolbachia:master manipulators of invertebrate biology［J］.Nat.Rev.Microbiol.，2008，6 (10):741-751.

Werren JH，Windsor D，Guo LR.Distribution of Wolbachia among Neotropical arthropods［J］.Proc.Royal Soc.Lond.B，1995，262 (1364):197-204.

West SA，Cook JM，Werren JH，et al.Wolbachia in two insect host-parasitoid commucities［J］.Mol.Ecol.，1998，7:1457-1465.

Zhou WG，Rousset F，O'Neil S.Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences［J］.Proc.Biol.Sci.，1998，265 (1395):509-515.