改进的EBSS培养液与常用商品化试剂对鼠胚体外发育的影响

饶金鹏，金敏，金帆

1.浙江大学医学院附属第二医院生殖医学中心，浙江杭州 310052；2.浙江大学医学院附属妇产科医院，浙江杭州 310006

在体外环境中，胚胎自身不具备任何屏障和保护功能，温度，湿度，尘埃，挥发性有机物（VOC），振动，噪音，光照等因素都会削弱胚胎的发育潜能[1]。而在诸多影响因素中，培养液是直接同胚胎接触的最常用也是最重要的消耗品，其性质直接决定着胚胎培养的结局[1-2]。小鼠胚胎生物学检测（mouse embryo assay,EMA）作为实验室质量控制（quality control,QC）的常规方法，在评估IVF 实验室培养液质量方面得到了广泛的应用[3]。旨在对新建IVF 胚胎实验室进行质量控制，同时探索胚胎培养液的性质，该院生殖中心对简单培养液EBSS 进行了一定的改进，并在2014年9月—2015年1月期间，将其应用于鼠胚的体外培养，并与改进前的EBSS 和另外两种商品化序贯培养液在4 细胞胚胎，8 细胞胚胎，融合胚以及囊胚形成率上进行了对比分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物 7 周龄雌性昆明系小白鼠（体质量30～35 g），10周龄雄性小鼠（体质量35～40 g），均购自浙江中医药大学实验动物中心，雌雄分笼饲养。

1.1.2 药物与试剂尿 促性素（HCG）与绒促性素（HMG）均购自丽珠制药厂。简单培养液EBSS 以及丙酮酸钠，乳酸钠及11 种氨基酸均购自SIGMA 公司，序贯培养液G1 和G2 以及配子处理液G-GAMETE 购自Vitrolife 公司，序贯培养液Quinn’s1026 和Quinn’s1029，人血清白蛋白（HSA）以及石蜡油均购自SAGE 公司。培养液均添加10%HSA，表面覆油后置于37 ℃,6.0%培养箱中平衡过夜。

1.2 实验方法

1.2.1 改进的EBSS 培养液的配制 卵裂培养液：向EBSS 中加入丙酮酸钠并使其浓度达到0.4 mmol/L，加入乳酸钠并使其浓度达到7 mmol/L，以及丙氨酸，天冬酰胺酸，甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸等5 种非必需氨基酸并使其浓度均达到0.1 mmol/L；囊胚培养液：调节乳酸钠浓度至5 mmol/L，加入丙氨酸，天冬酰胺酸，甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸等5 种非必需氨基酸并使其浓度均达到0.1 mmol/L（同卵裂培养液），加入精氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸，缬氨酸等6 种必须氨基酸并使其浓度达到0.25 mmol/L。

1.2.2 鼠胚获取与培养 雌鼠腹腔注射10 IU 的HMG，48 h 后再注射HCG，注射后立即将雌雄按1:1 的比例合笼，48 h 后取胚。将孕鼠颈椎脱臼处死后用眼科剪取输卵管放于覆油的G-GAMETE 配子处理液中，用1 mL 注射器针头将输卵管切割数次，挤出胚胎，再用拉细的巴斯德管将2 细胞鼠胚收集并随机分装到覆油的4 种不同培养液中，并置于培养箱中培养。当胚胎培养到8 细胞阶段，A 组将胚胎转移到新配制并于前1 d 过夜平衡后的EBSS 培养液，B，C,D 3 组分别将胚胎从卵裂培养液转移到经过夜平衡的囊胚培养液中继续培养。

1.2.3 鼠胚的观察 观察并记录24 h 后4 细胞胚胎形成率，48 h后8 细胞或融合胚形成率，72 h 后囊胚形成率。

1.3 统计方法

用SPSS 19.0 分析软件对所得计数数据进行χ2检验。

2 结果

在2014年9月—2015年1月期间，该院新建IVF 胚胎实验室共进行11 个周期的鼠胚体外培养实验，累计获取2 细胞胚胎870 枚，其中形成囊胚共614 枚，总体囊胚形成率为70.57%。鼠胚培养分成4 个组别进行，B，C，D 3 组的囊胚形成率显著高于A组，差异有统计学意义（P<0.001)，4 个组别的胚胎发育情况及囊胚形成率详见表1。鼠胚于覆油35 mm 皿中体外培养不同时期的生长情况见图1。

表1 鼠胚在4 个组别不同培养液中不同阶段的发育情况

图1 2-细胞鼠胚于覆油35 mm 皿中体外培养不同时期的生长情况图

3 讨论

严格的实验室质量控制与质量保障系统为胚胎的生长发育提供相对稳定的场所，建立稳定可靠的IVF 实验室对于最大限度地维持胚胎发育潜能，维持IVF 成功率具有重要的作用[1]。在体内，胚胎的外环境是输卵管液和子宫分泌液，而在体外，胚胎的环境即是与其直接接触的培养液。可以说，培养液的组分种类，组分含量和含量比，pH，渗透压等直接决定了胚胎培养的结局[4]。为了检测新建IVF 胚胎培养室是否达到人类胚胎培养标准，同时探索是否存在一种更加经济的培养液同样能达到与常用商品化试剂相同或相近的胚胎培养效果，该院生殖中心对EBSS 进行了改进，并与其他两种商品化培养液一起对昆明系小鼠胚胎进行体外囊胚培养实验。

通过对比简单培养液EBSS 与两种商品化序贯培养液的组成成分[1，5]，该研究发现简单培养液EBSS 在无机盐离子组分与浓度上与商品化培养液G1/G2，Quinn’s1026/Quinn’s1029 大 致 相同，说明3 种培养液都能对细胞内的离子水平进行调节，以维持胚胎外环境渗透压的稳定。但在胚胎发育所必需的能量物质方面，简单培养液EBSS 仅含有葡萄糖及低浓度的丙酮酸钠。由于处于早期分裂阶段的胚胎代谢活动相对较弱，细胞的氧化及生物合成水平较低，故不能很好地利用葡萄糖，而只能利用丙酮酸和乳酸作为能量来源[6]，这也导致了仅以EBSS 作为培养液的大部分小鼠胚胎发育均阻止在2 细胞阶段 （103 枚2 细胞中有71枚发育停滞，卵裂率仅为31.07%）。而简单培养液EBSS 的另外一个不足之处是其不含氨基酸等复合成分。尽管有证据表明，人胚胎可以在缺少氨基酸的培养环境中生长[7]，但氨基酸具有作为蛋白质类物质生物合成前体，能量来源，参与调节胚胎能量代谢，调节渗透压，调节pH，抗氧化，信息传递，调节胚胎分化和参与胚胎细胞基因表达等多种生物学功能[8-10]。而相关研究表明，在8 细胞期前，输卵管中非必需氨基酸浓度最高，胚胎也主要消耗此类氨基酸，而在8 细胞期后必须氨基酸则能刺激内细胞团的发育[11]，故胚胎在此阶段则同时利用非必需氨基酸和必须氨基酸。考虑到早期胚胎能量物质及氨基酸在胚胎发育中的重要作用，再参照G1/G2 和Quinn’s1026/Quinn’s1029 的组分情况，我们对EBSS 进行了必要的改进（参见实验方法1.2.1）。

鼠胚体外发育的结果显示，改进的EBSS 克服了2 细胞阻滞，在所获得的198 枚2 细胞中，有177 枚发育到4-5 细胞阶段，卵裂率为89.39%远高于未经改进的EBSS 31.07%，而在加入乳酸钠和11 种氨基酸改进成囊胚培养液后，其囊胚形成率72.22%也远高于改进前的26.21%，这一结果与美国梅奥医学中心的Morbeck 等最近在Fertility and Sterility 的研究报告显示的用SAGE系列序贯培养液的鼠胚囊胚形成率75%，以及用Vitrolife 系列序贯培养液的培养结果78%相近[5]，而由于通过改进后的EBSS 在成本上较之其他商品化培养液有大幅度的降低，说明其更经济，在鼠胚体外培养上具有更好的实用价值。

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