hTERC基因检测对宫颈癌的诊断价值及FISH技术检测优势

吕 威(综述)，曹志星(审校)

(珠海市第二人民医院病理科，广东珠海519020)

在女性生殖道肿瘤中，宫颈癌发病率位居首位［1］。在我国，其病死率仅次于卵巢癌，成为危害女性健康的首要疾病之一［2］。据德国、美国等研究报道，在过去的20年里，宫颈癌发病越来越年轻化;此外，我国吉林省的一项调查显示，近年来，年龄＜35岁的年轻宫颈癌患者占宫颈癌总患者的比例显著增加［3］。可见，宫颈癌发病呈年轻化趋势，并具有全球普遍性。值得庆幸的是，宫颈癌的癌前病变期较长，为 8～10年［4-5］。因此，对宫颈癌癌前病变进行及时有效的筛查是降低宫颈癌发病率和病死率的关键。目前，利用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybrid-ization，FISH)对宫颈病变细胞中人类染色体端粒酶(human telomerase RNA component，hTERC)基因的扩增状况进行检测，正在我国临床医学领域逐渐开展，现就其进展状况及优势予以综述。

1 宫颈病变

宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)被认为是宫颈浸润癌的前期病变，它的发生与卫生习惯及性生活混乱等因素密切相关，而病毒感染是其最根本的原因，如人类乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染［6］。在绝大多数病例中，CIN并不好发于宫颈正常鳞状上皮，反而多累及子宫颈鳞、柱交界处，即移行带或交界带［7］。传统上，将CIN分为3级:CINⅠ级相当于轻度非典型增生(累及上皮层下部1/3)，CINⅡ级相当于中度非典型增生(累及上皮层下部2/3)，而CINⅢ级相当于重度非典型增生和原位癌(累及上皮层2/3以上至全层)［8］。目前，又提出了一种新的宫颈病变分类系统，称为Bethesda分类，该系统最初用于宫颈细胞学诊断，即鳞状上皮内病变;按Bethesda分类可以分为低级别上皮内病变和高级别上皮内病变，低级别上皮内病变相当于CINⅠ级(以及某些HPV引起的不能诊断为CIN的病变)，而高级别上皮内病变则相当于CINⅡ级和CINⅢ级［9-11］。肿瘤细胞一旦突破基膜浸润至间质，则表示宫颈上皮内病变已进展至宫颈浸润性癌。一般而言，处于CINⅠ级、CINⅡ级，甚至部分CINⅢ级的宫颈病变是可逆的，理论上完全可以通过筛查的方式及时发现宫颈上皮内病变，从而进行合理治疗，降低其对女性的危害［6］。20世纪90年代，正是由于进行了大规模的宫颈癌前病变筛查，才使我国宫颈癌的病死率与70年代相比，降低了63.64%［12］。可见，合理筛查对于宫颈病变的防范尤为重要。

2 hTERC基因

2.1 hTERC 基因与端粒酶 正常体细胞分裂一定次数后就进入老化阶段，失去复制能力，称为复制性老化。细胞的复制次数是由一种特殊的DNA重复序列控制的，它位于染色体末端，称为端粒。细胞复制一次，端粒就缩短一点，当细胞复制一定次数和端粒缩短到一定程度后，就会被DNA修复机制(如“双链DNA断裂”)所识别，从而激活p53或视网膜母细胞瘤基因产物依赖的细胞周期G1期停滞或凋亡。而在生殖细胞和干细胞，由于端粒酶的存在可使缩短的端粒得以恢复，因此生殖细胞和干细胞具有十分强大的自我复制能力。肿瘤细胞，尤其在恶性肿瘤中，几乎能无限复制，这与端粒酶表达增加有关。实验表明，85%～95%的人类恶性肿瘤细胞均有一定程度的端粒酶活性，而人体正常细胞几乎没有此活性［13］(145-146)。端粒酶是一种具有逆转录活性的、依赖RNA的DNA聚合酶，将自身RNA作为模板，通过向端粒末端添加序列(TTAGGG)的方式维持端粒的长度，从而使细胞能够持续复制，得以永生。端粒酶主要包含人端粒酶RNA、人端粒酶逆转录酶和人端粒酶相关蛋白1三部分，这些结构的共同存在、协同作用使端粒酶能发挥永生化细胞的功能。其中，端粒酶的主体结构是hTERC，它的编码基因位于3号染色体长臂，此基因的扩增使宫颈细胞极易发生非典型性发育异常，进而转变为宫颈癌，这一观点已在2005年被美国国家卫生研究院的一项关于宫颈癌的研究所证实［14-15］。可见，hTERC基因在调控端粒酶活性及促使宫颈肿瘤发生、发展中发挥了非常关键的作用。

2.2 hTERC基因与HPV HPV是一种DNA病毒，它的基因组是双链的，呈闭合环状，其基因组大致包含3个基因区:上游调控区、早期编码蛋白区(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和晚期编码蛋白区(L1、L2、E4、E5)。根据HPV感染的不同后果，可将其分为低危型和高危型，低危型HPV感染可在数月至数年内被清除，并不引起宫颈病变，甚至没有任何临床症状，只是“一过性”的;而高危型HPV的持续性、慢性感染则与宫颈癌的发生和发展密切相关［16］。低危型HPV可引起生殖道乳头状瘤和癌前病变，其亚型主要包括HPV-6和HPV-11，且病毒的基因组尚未整合到宿主细胞DNA中;而在宫颈癌，高危型HPV-16或HPV-18的基因组已与宿主细胞的DNA进行整合，提示病毒DNA的整合对于加速肿瘤的发生、发展非常重要，不仅如此，整合的高危型病毒基因组在同一肿瘤的所有癌细胞中均在同一位置，提示整合方式是克隆性的;进一步分析发现，其整合位点总是在E1/E2开放阅读框架内，E2区的中断使HPV-16或HPV-18的E6和E7蛋白过度表达，进而扩增的E6和E7蛋白可与p53蛋白结合并导致后者降解，从而激活端粒酶，抑制细胞凋亡;或干扰p53基因转录，同时对hTERC基因及端粒酶的激活产生协同作用，促进癌症发生［13(153)，17］。Hopman等［18］的实验结论便充分印证了上述理论，他们用FISH方法检测宫颈病变中hTERC基因扩增和HPV整合情况的相关性，发现hTERC基因随着病变的加重，扩增率逐渐提高，且在hTERC基因扩增的病例中，HPV整合突出，提示hTERC基因扩增和HPV整合呈正相关，进而推测hTERC基因的扩增及端粒酶的激活可能与HPV致癌机制密切相关。

3 FISH

FISH的理论基础为核酸杂交，狭义的FISH指DNA-DNA杂交，广义的FISH指DNA-DNA和DNA-RNA杂交。无论狭义还是广义，均利用被检样本细胞中核酸序列与探针的互补性进行杂交，最终在荧光显微镜下观察是否有荧光信号表达以及表达数值的多少而得出结果。FISH包括直接法和间接法，直接法以荧光素直接标记已知探针，经过标本与探针的共同变性、杂交及漂洗等步骤后，可直接在荧光显微镜下观察结果;而间接法在标本与探针经历变性、杂交、漂洗之后，将荧光标志物同时与已知探针及其特异性抗体结合，进而放大待检信号;目前FISH已从单色发展至双色甚至多色，这使观察者能同时检测多个核酸序列有无异常［19］。FISH的实验材料可以是细胞涂片、冰冻组织切片或常规石蜡包埋组织切片等［13］(513)。由于FISH操作重复性好，具有很高的特异性和敏感性，目前已越来越多地应用于临床医学，如膀胱癌、乳腺浸润癌等的基因检测中。

4 FISH检测hTERC基因在宫颈病变中的应用与优势

研究表明，采用FISH检测宫颈细胞hTERC基因的扩增率，可作为CIN由低级别进展到高级别的指标，还可以提高宫颈癌前病变的筛查率，是一种损伤较小的、比较可靠的检测手段［20-23］。此外，任飞飞等［24］将直接涂片法、液基、石蜡切片等不同制片方法进行对比，发现在检测hTERC基因的宫颈癌筛查中，宫颈液基薄层细胞学检查制片法明显优于其他方法;但hTERC基因杂交成功率以石蜡包埋组织切片最高，为85.7%，同时，其荧光信号满意率也最高，且在指导宫颈病变及宫颈癌的治疗中，石蜡包埋组织切片法的染色体破坏最小，实际意义更大。目前，除FISH检测宫颈病变中hTERC基因的扩增情况外，宫颈病变筛查的主要方式还包括肉眼观察、宫颈细胞学检测、HPV检测及阴道镜检查等。其中，肉眼观察范围较局限，易漏诊颈管内病变，同时检查记录难以保存，质控困难;细胞学检查是一种形态学检查，受观察者专业知识、经验等主观因素的影响，有时难以作出客观、准确的诊断［25］;针对HPV感染的检测虽灵敏度高达84%～100%，但其特异度只有64%～95%，而且也只能检测出检查当时的HPV状态，其实大多数妇女，特别是性生活活跃的年轻女性，HPV感染只是暂时的，在一段时间内会自然转阴，并不会引发宫颈癌，这使HPV阳性的预测意义较低［26］;而阴道镜检查虽然无创、操作方便、可重复，但有研究表明，其检出高级别上皮内病变的灵敏度和特异度分别为19.1%和91.6%，检出低级别上皮内病变的灵敏度和特异度分别为82.1%和58.7%，提示阴道镜不适合作为筛查使用［27］。综上所述，鉴于宫颈癌筛查的关键性和重要性，急待寻找其他检测方法以弥补上述方法的不足。应用FISH检测hTERC基因的优势包括:①重复性好，定位准确;②敏感性与特异性高;③结果直接清晰，易于判读。

5 小结

研究显示，hTERC基因扩增阳性的患者治疗后病变复发率较阴性的患者高［28-29］，由此可知，应用FISH检测hTERC基因的扩增情况，不仅可用于宫颈病变筛查，还有可能作为预后指标。另外，将hTERC基因在宫颈病变及病变旁组织中的表达情况进行分析，从而试图在宫颈病变旁组织中找到一个合适的距离作为安全手术范围，最大可能降低复发率。可见，FISH检测hTERC基因的应用将在临床医学领域以其突出的优势发挥更大的作用。

［1］Minosse C，Garbuglia AR，Lapa D，et al.Genetic variability in E6，E7 and L1 protein of HPV81 from HIV-1 positive women in Italy［J］.New Microbiol，2010，33(1):25-35.

［2］崔英，胥爱辉，蔡永娥，等.人乳头瘤病毒(HPV)致宫颈癌的分子机制研究［J］.现代肿瘤医学，2008，16(1):143-145.

［3］郎景和.子宫颈病变防治的几个问题［C］.2008年全国子宫颈病变新进展研讨会论文集，北京，2008.北京:中国妇产科临床杂志社，2008:7-12.

［4］Bello BD，Spinillo A，Alberizzi P，et al.Cervical infections by multiple human papillomavirus(HPV)genotypes:prevalence and impact on the risk of precancerous epithelial lesions［J］.J Med Virol，2009，81(4):703-712.

［5］郭维婵.不同人群宫颈癌筛查现状［J］.医学综述，2011，17(24):3729-3731.

［6］赵春兰，王建，张会辰，等.宫颈癌及癌前病变筛查的现状和研究进展［J］.河北医药，2012，34(2):259-261.

［7］Howard L Jr，Erickson CC，Stoddard LD.A study of the incidence and histogenesis of endocervical metaplasia and intraepithelial carcinoma;observations on 400 uteri removed for non-cervical disease［J］.Cancer，1951，4(6):1210-1223.

［8］Richart RM.Cervical intraepithelial neoplasia［J］.Pathol Annu，1973，8:301-328.

［9］Joste NE，Rushing L，Granados R，et al.Bethesda classification of cervicovaginal smears:reproducibility and viral correlates［J］.Hum Pathol，1996，27(6):581-585.

［10］Solomon D.The 1988 Bethesda System for reporting cervical/vaginal cytologic diagnoses:developed and approved at the National Cancer Institute Workshop in Bethesda，Maryland December 12-13，1988［J］.Hum Pathol，1990，21(7):704-708.

［11］Crum CP.Symposium part 1:Should the Bethesda System terminology be used in diagnostic surgical pathology:Point［J］.Int J Gynecol Pathol，2003，22(1):5-12.

［12］杨玲，皇甫小梅，张思维，等.中国20世纪70年代与90年代子宫颈癌死亡率及其变化趋势［J］.中国医学科学院学报，2003，25(4):386-390.

［13］陈杰，李甘地.病理学［M］.2版.北京:人民卫生出版社，2012:145-146，153，513.

［14］莫伟英，黄莉，莫耀禧，等.荧光原位杂交技术检测人类宫颈端粒酶RNA组分基因的表达及其临床意义［J］.重庆医学，2013，42(1):13-15，18.

［15］Heselmeyer-Haddad K，Sommerfeld K，White NM，et al.Genomic amplification of the human telomerase gene(TERC)in pap smears predicts the development of cervical cancer［J］.Am J Pathol，2005，166(4):1229-1238.

［16］侯素平，张凤芹，张宪军，等.HPV检测在宫颈病变进展中的研究进展［J］.国际检验医学杂志，2014，36(9):1145-1146.

［17］Chan PK，Liu SJ，Cheung TH，et al.T-cell response to human papillomavirus type 58 L1，E6，and E7 peptides in women with cleared infection，cervical intraepithelial neoplasia，or invasive cancer［J］.Clin Vaccine Immunol，2010，17(9):1315-1321.

［18］Hopman AH，Theelen W，Hommelberg PP，et al.Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 are strongly associated eventa in the progression of uterine cervical dysplasia to invasive cancer［J］.J Pathol，2006，210(4):412-419.

［19］宋英君，王霞，赵爱琳，等.荧光原位杂交技术在检测宫颈上皮细胞hTERC基因扩增的应用进展［J］.泰山医学院学报，2010，31(12):974-976.

［20］Lan YL，Yu L，Jia CW，et al.Gain of human telomerase gene is associated with progression of cervical intraepithelial neoplasia gradeⅠ or Ⅱ［J］.Chin Med J(Engl)，2012，125(9):1599-1602.

［21］Yin G，Li J，Zhu T，et al.The detection of hTERC amplification using fluorescence in situ hybridization in the diagnosis and prognosis of cervical intraepithelial neoplasia:a case control study［J］.World J Srug Oncol，2012，10:168.

［22］Zheng X，Liang P，Zheng Y，et al.Clinical significance of hTERC gene detection in exfoliated cervical epithelial cells for cervical lesions［J］.Int J Gynecol Cancer，2013，23(5):785-790.

［23］Xiang L，Yang H，Li J，et al.Different amplification patterns of the human telomerase RNA gene in invasive cervical carcinomas and cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅲ［J］.Diagn Cytopathol，2012，40(10):849-855.

［24］任飞飞，赵淑萍，马德花，等.FISH检测宫颈脱落细胞与宫颈组织中hTERC基因制片方法的研究［J］.现代生物医学进展，2009，9(21):4126-4129.

［25］卢振华.宫颈癌常用筛查技术综述［J］.检验医学与临床，2011，8(2):206-208.

［26］Giorgi Rossi P，Chini F，Bisanzi S，et al.Distribution of high and low risk HPV typesby cytological status:a population based study from Italy［J］.Infect Agent Cancer，2011，6:2.

［27］费华丽.宫颈癌筛查研究进展［J］.国际妇产科学杂志，2010，37(5):314-317.

［28］杨维娜，尹利荣，段青，等.宫颈上皮内瘤变治疗前后hTERC基因表达结果分析［J］.天津医药，2010，38(8):654-656.

［29］史佃云，陈赛英，李桂梅，等.hTERC基因检测对筛查高危子宫颈病变预防宫颈癌的临床意义［J］.临床肿瘤学杂志，2011，16(11):979-983.