重症肌无力实验动物模型的研究进展

杨俊超(综述)，文颖娟(审校)

(陕西中医学院，陕西咸阳712046)

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种神经肌肉接头传递性功能障碍所引起的自身免疫性疾病，这种疾病病变部位主要在神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体(acetylcholine receptors，AchR)，表现为神经肌肉接头突触后膜上的AchR自身抗体介导的特异性自身免疫疾病，由于抗体阻断了这种神经肌肉的信号传递，产生了部分或全部骨骼肌易疲劳，呈波动性肌无力，活动后加重、休息后减轻、晨轻暮重等症状。为了进一步对人类MG发病机制有充分的认识，以便针对其不同的发病机制制订相应的缓解或治疗方案，现对近年来实验性MG动物模型的制备进行综述。

1 实验动物的选择

1.1 实验动物的种属 实验动物在免疫实验中作为人类的替身将在很大程度上影响实验研究的成败。常用的实验动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猪。大鼠由于抵抗传染能力较强，在国内生物医学研究领域中的广泛应用和使用数量已超过小鼠而居首位。近交Lewis大鼠由于MG模型制备的易患性较强而作为目前常用大鼠［1］，且其发病有急性期和缓解期，表现为一种快速的发病进程故而适用于实验研究。小鼠由于具有代表性的免疫系统，容易人为选择性地控制小鼠的免疫条件，区分淋巴细胞的不同功能亚群，得到近交系群体等特点，所以也常用于免疫学实验中。唐冰杉等［2］研究指出，近交系C57BL/6小鼠是比较公认的MG高敏感鼠，在免疫生物学中近交系小鼠C57BL/6是最为常用的小鼠。所以根据选择实验动物的近似性、重复性和均一性原则，动物种系的选择现多采用无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级别的近交Lewis大鼠和近交系C57BL/6小鼠。

1.2 动物的性别和年龄选择 医学专家在大量的临床观察后指出，MG患者以20～40岁多见，女性略多于男性，占全部病例的55%～60%［3］，这可能与雌激素水平有关，故在诱导实验性自身免疫性MG(experimental autoimmune MG，EAMG)的实验中绝大多数选择雌性动物。在实验动物造模研究中，根据自身性免疫原理，B淋巴细胞对AchR的记忆作用会导致年龄大的小鼠的肌无力模型建立成功率下降，但是这种记忆反应可被诱导弱化，即在初次抗原致敏后行再次免疫接种可提高小鼠的致病率，所以MG模型建立多采用适龄的小鼠作为实验对象［4］。

2 实验动物模型的制备方法

2.1 以AchR全蛋白为免疫原建立EAMG动物模型 以AchR全蛋白为免疫原建立模型的方法国外很早就开始使用，1973年Patrick等［5］首先从电鳗电器官提取纯化 AchR免疫接种新西兰大白兔后制成了主动免疫的自身免疫性EAMG模型，后来在大鼠、小鼠中用同样方法也制备了EAMG模型。这种从加利福尼亚电鳗器官中提取AchR是种天然的抗原，含有多个抗原决定簇，具有良好的免疫原性，能有效激活宿主的免疫系统［6］，但提取率低、提纯的过程复杂而且昂贵，故而此种模型制备方法难以普及推广使用。

2.2 采用合成AchR多肽片段为免疫原建立动物模型 由于天然AchR全蛋白不易获取，所以开始尝试用人工合成的方法来获取蛋白，并且取得了比较理想的结果。早在20世纪80年代，Lennon等［7-8］用人工合成的电鳗 α 亚单位上的AchRα125-147接种Lewis鼠来诱导EAMG模型，在观察MG临床变化的同时做迟发型超敏反应实验，结果表明，免疫的Lewis大鼠都有抗肽链抗体产生，出现了MG的临床症状和电生理改变，T淋巴细胞能识别 AchRα125-147并产生免疫应答，产生肌无力的症状。

近年来，Baggi等［9-10］用大鼠AchR亚基多肽片段在Lewis大鼠上成功地诱导了EAMG模型，发现效果很好，阳性率达73.3%。孙辰婧［11］用重组人AchRα中提取的AchR肽段片段来免疫大小鼠取得了和全蛋白免疫相似的效果，都诱导出了典型的肌无力模型症状。孟和宝力高和额尔敦［12］通过使用AchRα亚甲基基因片段联合白细胞介素6 DNA免疫原诱导Lewis鼠建立 EAMG模型，都取得了非常好的效果。Sun等［13］使用改进的方法重复性的重组人类骨骼肌AchR胞外域，获得了大量的子代受体，可诱导出EAMG，探索出了更加方便、经济的模型建立方法。

2.3 其他建立动物模型方法 除上述两种方法外，后来又出现了转移MG患者血清建立动物模型的方法，即用肌无力患者的血清及血清内成分注射到小鼠体内成功的建立出肌无力的动物模型［14］。包忠雷和闫晓波［15］在MG动物模型建立中提出，用处于急性期EAMG大鼠的AchR-Ab注射到Lewis大鼠来制备模型，但是此类模型不能从自身性免疫机制上模拟MG的发病情况，故而在临床研究上都有一定局限性。Losen等［16］用杂交瘤技术制备AchR-mAb单克隆抗体并诱导Lewis大鼠建立模型，出现了对外界刺激反映迟钝，体质量突然下降，成功地用 mAb35、mAbA7、mAbG10［17-18］等诱导制作出了EAMG动物模型。Richman等［19］发现，受体络氨酸激酶是神经突触受体的组成和功能维持的重要物质，并通过抵抗这种酶活性制备了肌无力模型。虽然这些模型制备方法都有成效，也有一定的临床意义，但是尚处于实验研究阶段，还没有建立起一套完善和规范的方案，稳定性和可重复性的把控还有待进一步研究。

3 评价动物模型建立的指标类型

3.1 临床肌力评分方法标准 Lennon等［20］在20世纪80年代已经制订出了比较科学的肌力评价标准分级方法，即将症状严重程度分为4级:0级，没有肯定的无力表现;1级，撕咬无力，四肢力量较差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少且易疲劳;2级，明显无力，休息时身体呈隆起姿势，头尾下垂，大腿外展，前肢趾弯曲，动作笨拙，行走不稳;3级，严重无力表现，无撕咬动作，肌肉震颇，呼吸困难，濒死或死亡。这种肌力的评价为以后评判标准的规范化奠定了基础。虽然这种观察法操作简单，但是主观性较强，容易产生评分级别误差。近年来提出一种强迫运动法，即强迫实验动物运动来观察疲劳程度，如强迫动物反复抓握测量抓握肌力的抓握法，强迫动物游泳并记录时间的游泳法和测量动物翻转悬挂的停留时间的翻转悬挂法。赵斌和刘降光［21］通过翻转悬挂法测量动物的肌力情况，并用统计学单因素方差分析得出了较为显著的结果，使肌力的评判变得更为客观。

3.2 AchR 抗体(AchR antibodies，AchR-Ab)的测量 AchR-Ab是最早发现的MG患者的检测指标之一，在MG诊断中已经作为一项最重要指标。EAMG患者血清中抗体的数量会明显增多，虽然并非患者均会有血清抗体阳性反应，但是在发病的绝大多数患者体内，AchR-Ab还是一个关键的检测指标，同时其滴度的大小还与疾病的严重程度呈正相关，因此抗体的检测一直受到高度重视，也已经建立了标准化的检测方法，即酶联免疫吸附法。这种方法具有灵敏度高、特异性强、所用试剂稳定、容易标准化、批量化操作等优势，已经得到了广泛的定性和定量分析。Liu等［22］通过实验研究表明，肌无力大鼠血清的免疫球蛋白含量增多，并提出减少免疫球蛋白的半衰期来治疗肌无力。

3.3 血清胆红素和尿酸的测量 周霞和孙中武［23］通过氧化酶定量分析法对MG患者血清胆红素和尿酸水平的检测，结果显示，MG患者血清中间接胆红素、总胆红素和尿酸水平均显著低于正常水平。这为评定MG模型的建立提供了更多的检测方法，为MG的治疗提供了新的思路和依据。

3.4 细胞免疫因子水平的检测 Bakhiet等［24］在EAMG动物模型体内发现，辅助性的Th1细胞产生的干扰素γ、肿瘤坏死因子α等细胞因子可以活化B细胞，使EAMG症状加重。Feferman等［25］通过抑制肌无力模型动物体内的干扰素来减轻肌无力的症状取得了良好效果，Th2细胞分泌抗炎性细胞因子能减轻EAMG症状，而Th3细胞分泌的转化生长因子β可以调节EAMG的症状表现。Uzawa等［26］对血清中的细胞因子白细胞介素4、白细胞介素15进行检测，发现这种细胞因子在MG患者中明显比正常人高，所以也可作为疾病检测指标之一。

3.5 肌电图电衰减反应的检测 对于MG患者，肌电图是常用的具有确诊价值的诊断方法，在MG患者中有80%在低频刺激时为阳性，且与病情轻重相关。肌电图电衰减反应的检测是目前最能反映神经肌肉接头神经电生理变化的检查方法。

3.6 骨骼肌病理形态学观察 王辉和张平［27］通过彩色细胞图像分析仪TJTY-400TC测量EAMG动物神经末梢面积、突触前后膜长度及其比值、突触前后膜面积，结果显示，神经末梢(突触前膜)变小、突触间隙增宽，平均突触后膜面积减小、突触后膜长度变短，突触后膜与前膜长度比值变小并且可见突触后膜皱褶丧失或减少，AchR密度减少，残余的突触后膜皱褶中有抗体和免疫复合物的沉淀。Serra等［28］通过实验表明，AchR形态的改变和Na+通道的异常会影响神经肌肉接头处信号传递，产生肌无力症状。宋雅芳等［29］、文颖娟和李志华［30］和文颖娟等［31］研究发现，MG患者的肌肉组织结构会发生变化且线粒体结构和数目也会发生变化。另外，韩磊等［32］研究发现，MG患者的骨骼肌中线粒体跨膜电位会随着后膜的损伤而降低。因此，这种通过透射电镜和流式细胞仪对线粒体检测也成为比较可信的检测依据。

4 问题与展望

MG实验动物模型的建立已经取得了很大进步，并且出现了多种模型制备方法，但也存在一些问题:①肌无力模型建立的方法虽多但不统一，没有探索出一套操作简单、复制率高、廉价容易推广的方法。②模型建立的不够典型，模型评判标准不统一，没有形成一套能很客观地评价模型成功与否的衡量标准。③检测的指标也不够多样和合理，虽然很多指标可以作为肌无力的检测指标，但是没有探索出其发病的根本机制和根本变异参数指标。④现有研究建立的EAMG动物模型的造模方法所需时间都较长，研究发病迅速的MG动物模型的制备方法也将是一个新的方向。近年来有研究表明［33］，MG模型不仅出现了四肢肌肉肌无力现象，还出现了因心肌和呼吸肌衰亡的致死现象，胃肠平滑肌的功能障碍出现胃肠蠕动性障碍的现象，以及眼睑下垂眼球运动障碍的现象，这将为模型的建立和肌无力机制的探讨提供更多的方向、方法。并且近年来MG检测方法也越来越多，涉及到线粒体、肌肉生成调控因子和基因片段损伤等多个领域，这将为进一步研究MG的发病机制以及探索MG治疗提供新的方向。

［1］关洁宾，陈忠平，李放花，等.30所医科院校学报应用实验动物的文献统计［J］.暨南大学学报:医学版，2000，21(2):135-137.

［2］唐冰杉，杨明山，曹学兵.实验性自身免疫性重症肌无力动物模型的研究概况［J］.国外医学:神经病学神经外科学分册，2002，29(3):265-268.

［3］姚健.胸腺切除治疗重症肌无力疗效及影响因素的分析［D］.长春:吉林大学，2005.

［4］朱丽君.重症肌无力动物模型的建立及中药治疗重症肌无力的机制研究［D］.长春:吉林大学，2011.

［5］Patrick J，Lindstrom J，Culp B，et al.Studies on purified eel acetylcholine receptor and anti-acetylcholine receptor anti-body［J］.Proc Nat Acad Sci，1973，70(12):3334-3338.

［6］Sanders DB，Schleifer LS，Eldefrawi ME，et al.An immunologically induced defect of neuromuscular transmission in rats and rabbits［J］.Ann N Y Acad Sci，1976，274:319-336.

［7］Lennon VA，Griesmann GA，McCormick DJ，et al.Definition of myasthenogenic Sites of the Human acetylcholine Receptor Using Synthetic Peptides［J］.Ann N Y Acad Sci，1987，505:439-450.

［8］Lennon VA，Mc Comick DJ，lambert EH，et al.Region of peptide 125-147 of acetyl chorine receptor alpha subunit is exposed at neuromuscular junction and induces experimental auto antibodies［J］.Proc Nail Acad Sci U S A，1985，82(24):8805-8809.

［9］Baggi F，Annoni A，Ubiali F，et al.Immunization with rat，but not Torpedo-derived 97-116peptide of the AchR alpha-subunit induces experimental myasthenia gravis in Lewis rat［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，998:391-394.

［10］Baggi F，Annoni A，Ubiali F，et al.Breakdown of tolerance to a self-peptide of acetylcholine receptor α-subunit induces experimental myasthenia gravis in rats［J］.J Immunol，2004，172(4):2696-2703.

［11］孙辰婧.诱导重症肌无力模型新方法并研究可溶性促衰变因子对其保护作用［D］.西安:第四军医大学，2013.

［12］孟和宝力高，额尔敦.AChR-α亚基基因片段联合IL-6 DNA免疫大鼠建立实验性重症肌无力模型［J］.免疫学杂志，2010，26(6):531-532.

［13］Sun C，Zhang H，Xu J，et al.Improved methodology to obtain large quantities of correctly folded recombinant N-terminal extracellular domain of the human muscle acetylcholine receptor for inducing experimental autoimmune myasthenia gravis in rats［J］.Arch Med Sci，2014，10(2):389-395.

［14］Burges J，Vincent A，Molenaar PC，et al.Paassive transfer of seronegative myasthenia gravis to mice［J］.Muscle Nerve，1994，17(12):1393-1400.

［15］包忠雷，闫晓波.重症肌无力动物模型的建立［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2010，17(1):6971.

［16］Losen M，Stassen MH，Martinez-Martinez P，et al.Increased expression of raspy in muscles prevents acetylcholine receptor loss in experimental autoimmune myasthenia gravis［J］.Brain，2005，128(10):2327-2337.

［17］Duan RS，Adikari SB，Huang YM，et al.Protective potential of experimental autoimmune myasthenia gravis in lewis rats by IL-10-modified dendritic cells［J］.Neurobiol Dis，2004，16(2):461-467.

［18］梁芙乳，高枫.重症肌无力的自身抗体及机制［J］.国际神经病学神经外科杂志，2006，33(4):346-346.

［19］Richman DP，Nishi K，Ferns MJ，et al.Animal models of antimuscle-specific kinase myasthenia［M］.Ann N Y Acad Sci，2012，1274:140-147.

［20］Lennon VA，lindstrom JM，Seybold ME，et al.Experimental autoimmune myasthenia gravis model of rats and guinea pigs［J］.J Exp Med，1975，141(6):1365-1375.

［21］赵斌，刘降光.胸腺五肽对实验性重症肌无力小鼠模型免疫功能的影响［D］.天津:天津大学，2007.

［22］Liu L，Garcia AM，Santoro H，et al.Amelioration of experimental autoimmune myasthenia gravis in rats by neonatal FcR blockade［J］.J Immunol，2007，178(8):5390-5398.

［23］周霞，孙中武.重症肌无力患者血清胆红素和尿酸变化及其意义［J］.中华医学杂志，2013，93(17):1287-1291.

［24］Bakhiet M，Yu LY，Ozenci V，et al.Modulation of immune responses and suppression of experimental autoimmune myasthenia gravis by surgical denervation of the spleen［J］.Clin Exp Immunol，2006，144(2):290-298.

［25］Feferman T，Aricha R，Mizrachi K，et al.Suppression of experimental autoimmune myasthenia gravis by inhibiting the signaling between IFN-gamma inducible protein 10(IP-10)and its receptor CXCR3［J］.J Neuroimmunol，2009，209(1/2):87-95.

［26］Uzawa A，Kawaguchi N，Himuro K，et al.Serum cytokine and chemokine profiles in patients with myasthenia gravis［J］.Clin Exp Immunol，2014，176(2):232-237.

［27］王辉，张平.神经肌肉疾病的临床与病理［M］.北京:人民卫生出版社，2007:296-301.

［28］Serra A，Ruff R，Kaminski H，et al.Factors contributing to failure of neuromuscular transmission in myasthenia gravis and the special case of the extraocular muscles［J］.Ann N Y Acad Sci，2011，1233:26-33.

［29］宋雅芳，胡任飞，刘友章，等.健脾祛湿方对重症肌无力模型大鼠骨骼肌线粒体及神经肌肉接头处超纤维结构的影响［J］.中药药理与临床，2010，26(1):65-68.

［30］文颖娟，李志华.葛根芩连汤及其拆方对UC大鼠结肠平滑肌线粒体跨膜电位的影响［J］.陕西中医学院学报，2012，35(6):68-72.

［31］文颖娟，周永学，王江.基于“线粒体-肌肉-脾”探讨脾胃失调与重症肌无力发病的关系［J］.现代中药，2013，33(5):25-28.

［32］韩磊，李鸣皋，马贵喜，等.血管紧张素对内皮细胞和线粒体跨膜电位的影响［J］.中国公共卫生杂志，2009，25(1):51-53.

［33］焦健.黄芪复方汤剂治疗脾肾虚损型Ⅱ型重症肌无力临床研究52例［D］.沈阳:辽宁中医药大学，2011.