转移性结直肠癌anti-EGFR治疗耐药分子标志物的研究进展*

潘映秋，章卫国，官正东，石卫武

(温州医科大学附属浙江省台州医院1.中心实验室；2.麻醉科，临海 317000)

·药学进展·

转移性结直肠癌anti-EGFR治疗耐药分子标志物的研究进展*

潘映秋1，章卫国1，官正东2，石卫武1

(温州医科大学附属浙江省台州医院1.中心实验室；2.麻醉科，临海 317000)

治疗转移性结直肠癌(mCRC)的表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体(anti-EGFR)靶向药物包括西妥昔单抗和帕尼单抗。靶向药物治疗mCRC达到了增加疗效和延长生存期的效果，但是部分患者对该类药物存在不敏感或耐药现象，其机制尚未完全揭示。伴随着EGFR信号通路研究的深入，越来越多的anti-EGFR治疗的耐药分子标志物被发现。KRAS突变是目前仅知的具有真正临床意义的anti-EGFR单抗治疗mCRC的独立耐药预测因素。此外EGFR基因拷贝数的改变，NRAS、BRAF、PIK3CA等基因突变，PTEN蛋白的失活，EGFR配体AREG/EREG的mRNA表达水平及miRNA Let-7 LCS6的多态性等都可能与anti-EGFR单抗治疗mCRC耐药相关。通过回顾近年来报道的西妥昔单抗和帕尼单抗治疗mCRC耐药相关的分子标志物，对其研究进展进行综述。

癌，结肠；癌，直肠；表皮生长因子受体；靶向治疗；耐药

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性消化道肿瘤之一，5年生存率60%，主要死亡原因为CRC的转移[1]。近年来，靶向抗肿瘤药物的出现，包括靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的单克隆抗体(EGFR monoclonal antibody，anti-EGFR)药物在转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)治疗中的应用，使越来越多的患者获益，提高疗效并延长生存时间[2]。然而，在临床应用的过程中，仅有10%～20%的mCRC患者可以从anti-EGFR治疗中获益，大部分患者对该类药物不敏感或存在耐药现象。由于该类药物价格昂贵，且存在一些无法避免的不良反应，因此如何筛选出可以从该类药物治疗方案获益的患者，是现今研究的热点。

EGFR为跨膜酪氨酸激酶受体，可以与不同配体结合发生磷酸化，形成二聚体激活下游MAPK和PI3K信号通路，参与肿瘤的发生发展[3]。以EGFR为靶向的药物，可阻断EGFR对下游信号传导通路的活化，治疗肿瘤[4]。目前，以EGFR为靶点的抑制药包括作用于EGFR受体胞外区的单克隆抗体和作用于EGFR受体胞内的酪氨酸激酶抑制药两类[5]。用于治疗mCRC的主要为靶向EGFR的单克隆抗体药物，包括西妥昔单抗和帕尼单抗。西妥昔单抗是一种EGFR的人鼠嵌合型单克隆抗体，靶向EGFR胞外结构，竞争性地抑制其与相关配体的结合，起到抗肿瘤的作用。帕尼单抗则是一种完全人源化的EGFR单克隆抗体，作用机制与西妥昔单抗类似，耐受性更好。

在应用anti-EGER单抗治疗肿瘤初期，认为该类药物仅对EGFR表达阳性的肿瘤患者有效，但在实际的应用过程中发现EGFR表达情况与药物治疗效果并无相关性。因此，研究者对EGFR信号传导通路中的其他相关分子进行了大量的研究，越来越多的潜在的耐药分子机制被揭示，涉及多种基因、蛋白及相关信号分子的异常表达和活化。

1 anti-EGFR治疗mCRC耐药相关分子标志物

1.1 EGFR 大量研究证实，EGFR基因拷贝数(gene copy number，GCN)的异常增加与西妥昔单抗和帕尼单抗治疗mCRC疗效相关。MORONI等[6]最先使用FISH技术检测EGFR GCN，证实EGFR GCN与西妥昔单抗和帕尼单抗治疗mCRC疗效相关。LAURENT-PUIG等[7]发现EGFR GCN异常增加患者的总有效率(71%)明显高于正常EGFR GCN(37%)患者。LI等[8]结合EGFR GCN和KRAS突变状态分析了74例接受西妥昔单抗治疗的mCRC患者的治疗效果，发现在KRAS野生型患者中，EGFR GCN FISH结果阳性(GCN>3)的患者总有效率和无进展生存期明显优于阴性患者。因此，EGFR GCN是一个有前景的anti-EGFR治疗mCRC疗效的预测因子。但在将该结论运用于临床之前，需要更多的研究数据支持，其检测方法和阳性判断阈值都必须进一步标准化和规范化。

1.2 KRAS KRAS是EGFR下游RAS-RAF-MAPK通路的关键信号传导分子，发生突变后将处于持续活化状态，使机体失去对EGFR下游通路的控制，导致肿瘤对anti-EGFR单抗耐药[9]。KRAS基因突变主要发生在外显子2的12位和13位密码子，其中12位密码子突变占KRAS基因突变的70%～80%，13位密码子突变占15%～20%，是目前仅知的具有真正临床意义的anti-EGFR治疗mCRC的独立耐药预测因素。研究证实，KRAS突变会导致mCRC患者对西妥昔单抗耐药[10-11]。DOUILLARD等[12]研究则发现KRAS突变会导致CRC患者对帕尼单抗耐药。葛飞娇等[13]回顾性分析了153例不同KRAS基因型的mCRC患者的临床特征、治疗方案和生存情况，发现KRAS野生型患者预后优于突变型。张斌等[14]评价了KRAS基因突变状态与西妥昔/帕尼单抗治疗mCRC 疗效间的关系，结果显示存在KRAS基因突变的患者对anti-EGFR治疗反应较差。除上述突变外，KRAS基因其余突变主要发生在61，146和154位密码子，有研究指出不同类型的KRAS突变对anti-EGFR治疗的耐药作用存在差异，但这部分的研究报道较少，仍待探索[15]。

此外，VALTORTA等[16]分析了1 039例CRC患者KRAS基因GCN的改变，发现0.67%患者KRAS GCN增加，且均为KRAS野生型，并对anti-EGFR单抗治疗无应答。尽管KRAS GCN增加发生的概率不高，研究报道也较少，但是这很可能是anti-EGFR单抗治疗mCRC发生耐药的分子机制之一。

1.3 NRAS NRAS是RAS致癌基因家族的成员之一，与KRAS高度同源，在CRC中的突变率为3%～5%，主要发生在61位密码子，其次发生在12和13位密码子，其突变与KRAS突变不共存[17]。研究发现KRAS野生型CRC患者中，NRAS突变型较NRAS野生型总生存期明显缩短，且与治疗方案无关[18]。扩大基因检测谱，联合检测KRAS外显子2，3，4和NRAS基因突变，将KRAS和NRAS均为野生型的患者定义为RAS野生型患者，评估帕尼单抗联合FOLFOX一线治疗转移性结直肠癌的疗效。结果发现KRAS第2外显子为野生型的患者有20%存在第3，4外显子或NRAS的突变，且不能从帕尼单抗的一线治疗中获益。而RAS野生型患者在帕尼单抗联合化疗的治疗中则显著获益，无进展生存期和总生存期均显著延长[19]。该研究提示，结合KRAS和NRAS的多个突变位点，扩大耐药基因检测谱，将有助于筛选出更多的anti-EGFR单抗耐药mCRC患者。

1.4 BRAF BRAF蛋白位于EGFR通路的KRAS分子下游，KRAS磷酸化活化BRAF后，再激活多种MAP激酶活化MEK/ERK通路，促进肿瘤增殖和侵袭。BRAF和KRAS突变一般不会同时发生，V600E是最常见的BRAF突变类型，占BRAF突变的95%，在约15%的CRC患者中存在[20]。DI NICOLANTONIO等[21]在79例KRAS野生型mCRC患者中发现11例存在BRAF V600E突变，这11例患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗无应答，且BRAF突变型mCRC患者的无进展生存期和总生存期明显短于BRAF野生型患者。YUAN等[20]系统性地评价了BRAF突变与anti-EGFR单抗药物治疗mCRC疗效之间的关系，该报道纳入21项研究的5 229例mCRC患者，结果表明BRAF野生型患者可通过anti-EGFR单抗药物治疗获益，尤其是在KRAS野生型患者中BRAF野生型患者较突变型无进展生存期和总生存期显著延长。以上研究均提示KRAS野生型患者进一步进行BRAF V600E位点的检测，将有助于筛选出一部分anti-EGFR治疗耐药患者。

1.5 PTEN和PIK3A PI3K-PTEN-AKT为EGFR另一条重要的信号传导通路。PTEN可通过脱磷酸化抑制PI3K-AKT通路活化，起抑癌作用，而PI3K则可通过磷酸化促进PI3K-AKT通路活化，起致癌作用。PTEN缺失和PIK3A基因突变都会导致PI3K效应子持续活化，促进肿瘤的发生发展。

研究显示，19%～42%的CRC患者PTEN蛋白表达缺失，其缺失可与KRAS、BRAF、PIK3A突变及EGFR GCN增加共存[7]。此外，10%～20%的CRC患者存在PIK3CA的活化突变，80%为PIK3CA的单碱基替代突变，其中60%～65%发生在外显子9(G1624A和E542K)，20%～25%发生在外显子20(A3140G和H1047R)，其突变可以与KRAS和BRAF突变共存[17]。RAZIS等[22]回顾性分析了147例接受西妥昔单抗治疗的mCRC患者的PTEN蛋白表达情况，发现PTEN表达阳性的KRAS野生型患者的疾病进展时间显著延长。SARTORE-BIANCHI等[23]的研究指出在接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗的KRAS野生型CRC患者中，PIK3CA突变患者的总有效率显著低于PIK3CA野生型患者，且无进展生存期明显缩短。THERKILDSEN等[24]系统性评价KRAS野生型患者中PIK3CA突变和PTEN蛋白功能缺失与西妥昔单抗和帕尼单抗治疗mCRC疗效之间的相关性，纳入22项研究的mCRC患者2 395例，结果发现PIK3CA突变和PTEN蛋白功能缺失患者的无进展生存期和总生存期显著缩短。但PTEN蛋白表达及PIK3CA突变与anti-EGFR单抗药物治疗效果之间的相关性还存在争议，其原因可能在于PTEN蛋白和PIK3CA基因异常可以与KRAS、BRAF等多种基因、蛋白异常共存，较难作为独立的预测因子，需要综合分析多种相关因素才能得出有效、准确的结论。

1.6 表皮调节素(epiregulin，EREG)和双调蛋白(amphiregulin，AREG) EREG 和AREG 为EGFR的配体，回顾性研究已经证实其表达水平在KRAS野生型CRC中可以作为anti-EGFR靶向药物的药效预测指标。JACOBS等[25]分析了西妥昔和伊立替康联用治疗的mCRC患者的AREG和EREG的mRNA表达水平，发现在KRAS野生型患者中，AREG和EREG mRNA高表达患者治疗应答显著升高，无进展生存期显著延长，而在KRAS突变型患者中则无差异。PENTHEROUDAKIS等[26]检测了226 例接受西妥昔单抗治疗的mCRC患者EREG和AREG的mRNA表达水平。结果发现 KRAS野生型患者中，AREG高表达与总生存期相关(HR0.47，95%CI0.3～0.7)，其高表达有助于KRAS野生型患者从西妥昔治疗中获益；而EREG高表达与总生存期的相关性(HR0.45，95%CI0.28～0.70)与KRAS基因状态无关，提示EREG可能可以作为不依赖于KRAS基因突变状态的一个独立的疗效预测指标。基于以上研究结果，AREG和EREG的表达水平可作为mCRC患者anti-EGFR治疗疗效的预测因子，但该类研究数据量不大，尚缺乏规范的检测手段和判断标准，需要多中心、大规模的研究来获得更准确的结论。

1.7 Micro-RNA Micro-RNA为非编码小RNA，可以通过与mRNA相应位点的结合来调控基因表达，其多态性存在于miRNA与功能基因结合位点附近，通过干扰miRNA功能影响功能基因的表达，干扰药物应答导致耐药[27]。miRNA中Let-7家族可结合至KRAS mRNA 3′端非翻译区的互补位点(complementary site，LCS)，下调RAS表达。KRAS mRNA 3′端非翻译区的Let-7的LCS6若发生单碱基突变T>G(rs61764370)，其与KRAS mRNA的结合能力可发生改变[28]。GRAZIANO等[29]发现LCS6 GG或GT单碱基突变的mCRC患者西妥昔单抗治疗疗效更好。因此Let-7 LCS6多态性可预测西妥昔单抗治疗mCRC的疗效，是一个很有前景的耐药预测分子标志物。但相关研究数据都是建立在回顾性分析基础上，数据较少，缺乏多中心大范围前瞻性的研究数据支持。

1.8 其他 Met受体激酶途径是新提出的可能导致anti-EGFR治疗mCRC产生耐药的机制之一，Met的活化可激活EGFR下游信号传导通路。INNO等[30]报道在73例接受西妥昔单抗治疗的mCRC 患者中，c-Met过表达与耐药相关。HEINDL等[31]也报道了Met的高表达与EGFR活化相关，并可导致西妥昔单抗耐药。此外，表皮生长因子受体-2(HER-2)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)/IGF-1R、Fc-γ(fragment c gamma)受体、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、EGFR信号通路下游调控基因cyclin-D1等均报道与anti-EGFR单抗治疗mCRC中产生耐药存在一定的相关性，但是结果尚有争议，有待深入研究。

2 结束语

目前，临床应用西妥昔单抗和帕尼单抗治疗mCRC前，可通过检测患者KRAS基因状态，针对个体情况选择用药方案。尽管KRAS突变患者几乎全都对该类药物耐药，但其敏感度不高，尚无有效指标对KRAS野生型患者中的耐药患者进行进一步的筛选。

研究发现，EGFR GCN，NRAS、BRAF、PIK3CA的突变，PTEN表达缺失，AREG/EREG的mRNA表达水平及miRNA Let-7 LCS6的多态性等与anti-EGFR单抗治疗mCRC的疗效存在一定关联，是具有临床应用前景的耐药预测分子标志物。通过多中心大数据的前瞻性的研究，联合分析CRC患者EGFR信号传导通路中的多个相关分子标志物，建立标准化和规范化的检测手段和分析方法，对各相关分子标志物的预测作用进行确认，最终转化至临床应用，必将有助于提高预测疾病预后及相关药物疗效的准确率，可以更好地指导临床个体化用药。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.021

2014-02-19

2014-05-30

*浙江省公益性技术应用研究计划(2014C33157)；浙江省医药卫生科技计划(2014KYA225)

潘映秋(1983-)，女，浙江台州人，助理研究员，硕士，主要研究方向：药物基因组学。电话：0576-85199344，E-mail：panyq@enzemed.com。

石卫武(1975-)，男，浙江台州人，副主任技师，主要研究方向：临床基因诊断。电话：0576-85199344，E-mail：shiww@enzemed.com。

R979.1；R735.3

A

1004-0781(2015)01-0077-05