不同提取工艺对鄂产绿茶多糖体外降糖活性的影响*

贾亮亮，奚炜，彭官良，曾晓，陈进兵，金桂兰

(三峡大学人民医院·宜昌市第一人民医院药学部，宜昌 443000)

不同提取工艺对鄂产绿茶多糖体外降糖活性的影响*

贾亮亮，奚炜，彭官良，曾晓，陈进兵，金桂兰

(三峡大学人民医院·宜昌市第一人民医院药学部，宜昌 443000)

目的 探讨不同提取方法对鄂产绿茶多糖降糖活性的影响。方法 分别采用酶法、热水提取法、冷水提取法提取鄂产绿茶的茶多糖。 通过体外实验观察不同提取方法所得绿茶多糖对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、蔗糖酶活性影响，选出对酶抑制作用最强的多糖。结果 3种提取方法所得绿茶多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用无明显差别；酶法所提绿茶多糖对α-淀粉酶、蔗糖酶活性强于热水提取法、冷水提取法所得的绿茶多糖。结论 酶法提取的绿茶多糖具有较好的体外降血糖活性。

绿茶多糖；提取工艺；降糖活性

糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性疾病，是继心血管疾病及肿瘤之后的第三大疾病。因糖尿病引发的心、脑、肾、眼、神经等并发症给患者身心造成巨大痛苦。我国及日本民间一直流传用泡饮茶叶辅助治疗糖尿病[1]。文献也报道茶多糖具有降低血糖的作用[2-3]。茶多糖是一种具有复杂空间结构的大分子化合物，产地、品种、提取分离方法等因素都会影响其空间结构进而影响其生物活性，这些不确定的因素极大制约了茶多糖的进一步开发利用。笔者利用湖北省宜昌市茶叶资源丰富的特点，通过评价不同提取方式对茶多糖体外降糖活性的影响，筛选出具有最优降糖活性的茶多糖的提取工艺，为鄂产茶叶的多元化开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂 绿茶购自湖北省宜昌市，经三峡大学湖北省天然产物研究与利用重点实验室汪鋆植副教授鉴定为山茶科山茶属植物鄂产绿茶(Camelliasinensis)。经粉碎后过筛孔内径0.25 mm(60目)筛备用；α-葡萄糖苷酶(批号：0009001427)、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenol β-D-glucoside，PNP-G)(批号：000376-7280)、蔗糖酶(批号：0009001574)均购自Sigma公司；阿卡波糖(批号：BJ00347)购自拜耳医药保健有限公司；纤维素酶(批号：20120427)、α-淀粉酶(批号：20120514)均购自国药集团化学试剂有限公司，其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 仪器 TYPE1500-458全波长型酶标仪(美国Thermo Electron公司)；单道移液器(法国Gilson公司)；96孔酶标板(德国 Greiner公司)。WFZ UV-2100型紫外-可见分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公司]；LD4-4型落地式低速大容量离心机(北京京立离心机有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；RetschZM100型粉碎机[德国Retsch(莱驰)有限公司]。

1.3 茶叶原料的处理 绿茶350 g，磨碎后用体积分数为95%乙醇3 000 mL提取2 h，提取2次除去茶叶中的色素、多酚类等脂溶性杂质，回收乙醇，茶渣自然风干后备用。

1.4 不同提取方法

1.4.1 热水提取茶多糖 取“1.3”项下处理过的茶渣90 g，沸水提取2次，料液比分别为1：10，1：8，时间均为2 h，3 500 r·min-1离心15 min，合并2次上清液，浓缩至750 mL，加入3倍体积的95%乙醇沉淀(测得溶液的终浓度为80%)，低温静置过夜，3 500 r·min-1离心15 min，沉淀挥发去多余乙醇后，加水溶解到400 mL，加入1/3体积的Sevag试剂(三氯甲烷溶液：正丁醇=4：1)，室温下搅拌30 min，静置2 h，取上层水相，3 500 r·min-1离心15 min，取上清液，重复4次，60 ℃真空干燥。

1.4.2 冷水提取茶多糖 取“1.3”项下处理过的茶渣90 g，冷水电磁搅拌提取3.5 h，料液比为1：10，加入3倍体积的 95%乙醇沉淀(测得溶液的终浓度为80%)，低温静置过夜，3 500 r·min-1离心15 min，沉淀挥发去多余乙醇后，加水溶解到400 mL，加入1/3体积的Sevag试剂(三氯甲烷溶液：正丁醇=4：1)，室温下搅拌30 min，静置2 h，取上层水相，3 500 r·min-1离心15 min，取上清液，重复4次，60 ℃真空干燥。

1.4.3 酶法提取茶多糖 取“1.3”项下处理过的茶渣90 g，茶渣与水的质量比1：10，温度 45 ℃，pH 4.5，加0.5%纤维素酶量，提取 120 min，浓缩滤液，加入3倍体积的 95%乙醇沉淀(测得溶液的终浓度为80%)，低温静置过夜，3 500 r·min-1离心15 min，沉淀挥发去多余乙醇后，加水溶解到400 mL，加入1/3体积的Sevag试剂(三氯甲烷溶液：正丁醇=4：1)，室温下搅拌30 min，置分液漏斗中静置2 h，取上层水相，3 500 r·min-1离心15 min，取上清液，重复4次，60 ℃真空干燥。

1.5 绿茶多糖含量的测定

1.5.1 标准曲线的绘制 取105 ℃干燥至恒质量的分析纯葡萄糖500 mg，精密称定，溶于纯化水，定容至500 mL，分别吸取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 mL置25 mL量瓶中，以纯化水定容，吸取葡萄糖稀释液1.0 mL，置于具塞试管中，加入0.2%蒽酮试剂4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷却5 min后，放入热水浴中，管口加盖玻璃塞，以防蒸发，准确煮沸10 min取出，自来水冷却。室温放置10 min，以波长610 nm测吸光度(A)，绘制葡萄糖标准曲线。线性回归方程：Y=0.076X+0.012 4，R2=0.992。 线性范围为40～160 μg·mL-1。

1.5.2 总糖含量的测定 取热水提取物、冷水提取物、酶法提取物各12.5 mg，分别置于10 mL量瓶，加水溶解并定容。分别取葡萄糖溶液0.5 mL置于具塞试管中，加入0.2%蒽酮试剂4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷却5 min后，放入热水浴中，管口加盖玻璃塞，以防蒸发，准确煮沸 10 min取出，自来水冷却。室温放置 10 min，以波长610 nm测定A值。

1.6 不同提取方法所得绿茶多糖体外对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、蔗糖酶活性影响

1.6.1 对α-葡萄糖苷酶活性的影响 根据马继雄等[4]介绍的方法，α-葡萄糖苷酶在37 ℃条件下可以水解其底物对硝基酚-葡萄糖，产生对硝基酚，以水解20 min内反应体系中对硝基酚的生成量来计算茶多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

反应体系：取67 mmol·L-1、pH=6.8磷酸钾缓冲液250 μL，10 mmol·L-1对硝基酚-葡萄糖溶液50 μL，分别加入的质量浓度为0.312，0.625，1.250，2.500，5.000 mg·mL-1各组多糖提取物50 μL 和0.1 U·mL-1α-葡萄糖苷酶50 μL，混匀后置于37 ℃水浴孵育20 min，然后加入1 mol·L-1碳酸钠溶液100 μL终止反应。每组中用纯化水代替酶液作为空白对照，阿卡波糖作为阳性对照。将反应液置于全波长型酶标仪中，在波长405 nm下测各孔A值。

按照抑制率的定义，样品提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按照下式计算：抑制率(%)=(A1-A2)/A1×100%。式中：A1为酶与底物反应后的吸光度，A2为加入抑制剂后酶反应的吸光度。

1.6.2 对α-淀粉酶活性的影响 酶活性的定义：一个单位的抑制剂活力定义为在上述条件下每毫升抑制剂溶液在每分钟内抑制α-淀粉酶消耗淀粉的量(mg)[5]。根据抑制活力的定义，需要建立A值与淀粉浓度之间的方程式。配制不同浓度的淀粉溶液，分别取淀粉溶液0.5 mL，加2 mol·L-1盐酸0.3 mL，纯化水4.0 mL，加0.01 mol·L-1碘溶液0.2 mL显色，在600 nm波长处测定A值。以淀粉浓度为横坐标，A值为纵坐标绘制淀粉标准曲线。线性回归方程：Y=1.083 3X+0.089 6，R2=0.998，线性范围为：0.16～0.72 mg·mL-1。

取0.1 U·mL-1α-淀粉酶0.3 mL和质量浓度为0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 mg·mL-1各组绿茶多糖溶液0.7 mL于试管中，在37 ℃条件下预反应30 min后，加入0.4 mg·mL-1淀粉溶液0.5 mL再反应15 min，用2 mol·L-1盐酸0.3 mL中止反应，加纯化水使各管溶液终体积为4.8 mL，加0.01 mol·mL-1碘溶液0.2 mL显色，在600 nm处测定A值。每个样品在同一浓度下做3个平行实验，取平均值。阿卡波糖作为本法的阳性对照，同时设定空白对照和阴性对照。

酶活性抑制率(%)=(A1-A2)-0.089 6)/1.083 3n×100%

式中：A1为加入抑制剂后酶反应的吸光度，A2为酶与底物反应后的吸光度，n为加入抑制剂体积(mL)。

1.6.3 对蔗糖酶活性的影响 用pH=4.5的醋酸钠溶液配制10 mg·mL-1蔗糖溶液，取蔗糖溶液0.9 mL，分别加入各组绿茶多糖溶液0.5 mL，混匀，55 ℃水浴5 min。水浴后各管加入1.5 U·mL-1蔗糖酶0.1 mL，55 ℃水浴20 min，采用葡萄糖氧化酶法，在505 nm波长下测定A值，以葡萄糖的生成量计算蔗糖酶抑制活性，阿卡波糖作为本法的阳性对照，同时设定空白对照。

抑制率(%)=(A1-A2)/A1×100%

式中：A1为酶与底物反应后的吸光度，A2为加入抑制剂后酶反应的吸光度。

2 结果

2.1 不同提取方法对茶多糖提取率的影响 沸水提取、酶提取和冷水提取所得多糖含量分别为2.58%，1.59%，0.86%。可见，3种提取方法中沸水提取所得多糖的得率最高，其次为酶提取法，得率最低为冷水提取法。

2.2 不同提取方法所得茶多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响 见图1。3种提取方法所得绿茶多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均较低，抑制率均<20%。且3种提取方法所得茶多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用无明显差异，表明绿茶多糖降血糖作用与抑制α-葡萄糖苷酶活性无关。

2.3 不同提取方法所得茶多糖对α-淀粉酶活性的影响 见图2。3种提取方法中，酶提取法所得茶多糖对α-淀粉酶活性抑制作用强于热水提取及冷水提取法，其原因可能与酶解法条件温和，对茶多糖天然空间结构破坏较小，较好保留了茶多糖生物活性有关。

2.4 不同提取方法所得茶多糖对蔗糖酶活性的影响 见图3。3种提取方法中，酶提取法所得茶多糖对蔗糖酶活性抑制作用强于热水提取法及冷水提取法，其原因可能与酶提取法作用温和、对茶多糖天然空间结构破坏较小、较好地保留了茶多糖的生物活性有关 。

3 讨论

多糖属于极性大分子化合物，通常选择水作为溶剂进行提取，可以用热水浸煮提取，也可用冷水浸提[6]。溶剂提取为常用的传统方法之一，成本低，不需特殊设备，但是其提取效率较低，影响其进一步推广。酶工程技术是近年来用于天然植物有效成分提取的一项生物工程技术。选用恰当的酶，可较温和地将植物组织分解，加速有效成分的释放，从而提高其提取率[7]。并且其作用条件温和，可最大程度地保持多糖分子的空间构型，从而保证多糖的生物活性不发生改变[8]。

图1 3种提取方法所得茶多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响

Fig.1 Effect of tea polysaccharide extracted by three methods on α-glucosidase activity

图2 3种提取方法所得茶多糖对α-淀粉酶活性的影响

Fig.2 Effect of tea polysaccharide extracted by three methods on α-amylase activity

图3 3种提取方法所得茶多糖对蔗糖酶活性的影响

Fig.3 Effect of tea polysaccharide extracted by three methods on invertase activity

α-葡萄糖苷酶位于小肠刷状缘膜上皮细胞，能将双糖水解成可被小肠吸收的单糖，是食物中碳水化合物水解的关键酶。因此，抑制该酶能够延缓碳水化合物的消化，减少葡萄糖吸收入血，进而抑制餐后高血糖[9-11]。 α-淀粉酶抑制剂属于糖(苷)水解酶抑制剂，能有效地抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少糖分的摄取，降低血糖和血脂含量，进食后不产生高血糖症，从而使胰岛素分泌减少，脂肪合成降低，体质量减轻。α-淀粉酶抑制剂目前在医药和农业上具有广泛的用途，临床上用于防治糖尿病、 高血糖、 高血脂等[12]，其在体内对胰腺或唾液中的α-淀粉酶有很强的抑制作用，并能降低血糖和血脂的浓度[13-14]。蔗糖酶是小肠内重要的双糖酶，主要存在于小肠绒毛顶端，由小肠绒毛上皮细胞合成分泌，水解蔗糖生成葡萄糖和果糖，对小肠消化及吸收功能具有重要意义[15]。许多药物降血糖的机制与抑制肠道内蔗糖酶活性有关[16-17]。因此，笔者观察不同提取方法所得绿茶多糖对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶及蔗糖酶的活性的影响，以便筛选出降糖活性最强的一组绿茶多糖。

本研究结果显示，鄂产绿茶多糖对α-葡萄糖苷酶活性影响较小，且3种提取方法所得茶多糖在抑制α-葡萄糖苷酶活性方面没有明显差异；而酶法提取的绿茶多糖对α-淀粉酶和蔗糖酶活性的抑制作用优于水溶剂提取法，其原因可能是酶提取方法较温和，对多糖空间结构的破坏较小，最大程度保留了鄂产绿茶多糖的活性。冷水浸提法虽然条件亦温和，但是多糖的浸出效率太低，短时间内无法使尽可能多的不同相对分子质量、不同酸碱性的多糖被提取出来，有活性的多糖分子相对较少，从而使其对α-淀粉酶和蔗糖酶活性的抑制作用弱于酶提取法所得的茶多糖。

茶多糖调节血糖的作用近年来被广泛研究，但是茶多糖来源、品种、提取方法等因素对其降血糖作用的影响方面的研究较少。笔者研究了不同提取工艺对鄂产绿茶多糖降血糖作用的影响，以期为鄂产绿茶进一步的开发利用提供理论支持。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.002

Influence of Different Extraction Technologies on Hypoglycemic Activity ofHubeiGreen Tea PolysaccharideinVitro

JIA Liangliang,XI Wei,PENG Guanliang,ZENG Xiao,CHEN Jinbing,JIN Guilan

(DepartmentofPharmacy,People'sHospitalofSanxiaUniversity,theFirstPeople'sHospitalofYichang,Yichang443000,China)

Objective To investigate the influence of different extraction methods on hypoglycemic activities of polysaccharides fromHubeigreen tea. Methods Different green tea polysaccharides were extracted by enzymatic extraction, hot water extraction or cold water extraction, respectively.The inhibitory activities of the extract on α-glucosidase, α-amylase and invertaseinvitrowere investigated to determine the most efficient extraction technique. Results There was no significant difference in the inhibition of α-glucosidase by polysaccharides from three different extractions.The polysaccharides extracted by enzyme method were more active on α-amylase and invertase than those extracted from hot water and cold water methods. Conclusion The green tea polysaccharides extracted by enzyme method showed better hypoglycemic activityinvitro.

Green tea polysaccharide; Extraction technology; Hypoglycemic activity

2013-10-14

2014-02-12

*宜昌市科技研究与开发项目(A12301-21)

贾亮亮(1985-)，男，山西原平人，药师，硕士，主要从事中药药理学及临床药学研究。电话：0717-6221372，E-mail：jialiang822@163.com。

金桂兰(1968-)，女，湖北宜昌人，主任药师，硕士，主要从事医院药学及药物制剂学研究。电话：0717-6228045，E-mail：jin_gl@163.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)01-0007-04