肿瘤多药耐药性体外模型的方法与评价

乔婷婷(综述)，彭　芳(审校)

(大理学院药学与化学学院，云南 大理 671000)

肿瘤多药耐药性体外模型的方法与评价

乔婷婷△(综述)，彭芳※(审校)

(大理学院药学与化学学院，云南 大理 671000)

摘要：建立优势肿瘤多药耐药性体外模型有助于阐明多药耐药的相关机制、优化现有抗肿瘤药物评价方法，并为肿瘤多药耐药逆转研究以及开发新的抗肿瘤药物提供参考。该文介绍了肿瘤多药性体外模型的建立方法，并对药物大剂量间断冲击法、药物浓度递增法、大剂量间断冲击法结合浓度递增法以及转基因法结合药物等建模方法进行综合评价。

关键词：肿瘤；多药耐药；模型；评价

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是当今肿瘤治疗的一大难题，据美国癌症协会估计，>90%的肿瘤患者死于不同程度的耐药，肿瘤多药耐药性(multiple drug resistance，MDR)是肿瘤治疗的主要障碍[1]。MDR是指在肿瘤治疗中，肿瘤复发后对曾经使用过的有效抗肿瘤药物以及未曾用过的作用和机制尚不明确的其他抗肿瘤药物无效[2]。目前对肿瘤耐药机制的研究已经取得了重要进展[3]。肿瘤细胞膜上P-糖蛋白转运蛋白的高表达是MDR的主要作用机制之一，该蛋白是膜转运蛋白家族中的一员[4-6]。建立体外MDR模型是探讨体外抗肿瘤方法的一种重要手段[7]。现针对MDR模型的建立方法、特点及检查指标进行归纳整理，为进一步筛选有效逆转肿瘤MDR的药物、提高化疗效果提供理论参考。

1肿瘤MDR体外模型的建立方法

在体外建立肿瘤耐药细胞株至今已有20多年的历史，目前，建立多药耐药细胞株的方法大体可分为：药物大剂量间断冲击法、药物浓度递增法、大剂量间断冲击结合浓度递增法、射线照射、基因转染和转基因结合药物筛选法等。其中，药物大剂量间断冲击法和药物浓度递增法是体外诱导耐药细胞株的常用方法[8-9]。

1.1药物大剂量间断冲击法也称为短时接触培养法，其是给予细胞较高浓度的抗肿瘤药物，作用短暂时间后换用不含药物的培养基让其继续生长，换液处理漂浮起来的细胞，当细胞达到一定数量时重复上述方法继续诱导，由此得到稳定的、具有耐药性的细胞株[10]。该方法在给药时间上与临床化疗周期相似，省时方便、不易污染，但可能对细胞造成较大的伤害，且诱导时间长、步骤繁杂，细胞较易死亡[11]。由于其可以提高疗效、减少化疗药物带来的不良反应，该方法常用于临床。

诱导耐药的药物主要有阿霉素、5-氟尿嘧啶、雷替曲塞、顺铂以及紫杉醇等。延冰等[12]给予处于对数期的人胃癌细胞株BGC823大剂量顺铂，诱导形成人胃癌耐药细胞株BGC823/顺铂。郑婷婷等[13]采用大剂量阿霉素间歇诱导人乳腺癌细胞MCF-7形成耐药人乳腺癌细胞模型MCF-7/阿霉素。胡杰等[14]使用高浓度阿霉素对人肝癌细胞株7721进行间歇诱导，经历21个月后成功培养成7721/阿霉素人肝癌耐药细胞模型。

1.2药物浓度梯度递增法又称逐步诱导法、小剂量逐步增加剂量持续给药法。该方法是将化疗药物从低浓度开始，逐渐增加药物浓度，将肿瘤细胞培养于该培养基中诱导，直至产生耐药性[15]。杨琰等[16]运用浓度梯度递增法，采用紫杉醇进行诱导，历时6个月，成功获得卵巢癌耐紫杉醇细胞株SKOV3-ts。张福军等[17]采用顺铂诱导口腔腺样囊性癌Acc-3细胞成功建立耐药细胞系Acc-3/顺铂。该方法较常用，建立的细胞系耐药性稳定、可靠，诱导所需时间短，建立的耐药细胞株在冻存或撤药后仍有较高的耐药性，且耐药倍数大于大剂量冲击法，但其建立的耐药模型的增殖能力较低[18]。

1.3大剂量间断冲击法结合浓度递增法该方法是将以上两种方法结合起来，其可以很好地模拟临床上肿瘤出现的多药耐药现象。徐小方和曹云新[19]采用浓度梯度递增法联合大剂量冲击诱导人涎腺黏液表皮样癌细胞株MEC，并成功得到了人涎腺黏液表皮样癌多药耐药细胞系MEC/5-氟尿嘧啶。陆海等[20]使用此方法诱导建立人结肠癌奥沙利铂多药耐药细胞系HCT116/L-OHP。这种方法建立的耐药株耐药倍数高于大剂量间歇冲击法，其稳定性好，但操作步骤复杂、培养时间较长，且剂量大小不易掌握[21]。

1.4化学诱变剂、射线照射化学诱变剂、射线辐射作为诱变剂，可提高基因变异概率，增加细胞诱导成功率，其有助于在短时间内提高对耐药细胞的筛选，可作为耐药模型建立的辅助方式。李明耀[22]选取对X线相对敏感的鼻咽癌细胞株CNE-2进行间歇性大剂量γ射线照射，在产生明显辐射抗拒性的同时，也产生了MDR，获得了鼻咽癌辐射抗拒细胞株CNE-2R。此方法在卵巢癌、人脑胶质瘤、人喉鳞癌等的治疗中发挥着不可替代的作用。

1.5基因转染该方法是将MDR1基因转染敏感细胞株，从而获得耐药细胞株，此种耐药表型的特点是耐药基因型单纯、转染率不高，且在转染过程中易因新基因的插入引起细胞性状的改变[23]。

1.6基因转染和转基因结合药物筛选法该方法是近年来新兴的一种建立多药耐药细胞株的方法，该方法建立模型所用时间短、耐药性基因型单纯、耐受性强、效率高且不易丢失，但技术复杂，要求的设备先进且不能用于多种复杂细胞株的建立，转染率不高[24]。

2建立模型的检测指标与评价方法

评价耐药模型的方法包括：细胞形态学观察、生长曲线测定、耐药倍数检测、耐药标志物检测及耐药机制检测。

2.1倍增时间测定及细胞形态学观察陈婕和王家东[24]在建立喉癌耐药细胞株Hep2/5-氟尿嘧啶的过程中对耐药细胞的生物学特性进行观察，观察耐药细胞和亲本细胞的形态学变化，采用流式细胞术对细胞周期和细胞凋亡率进行检测，以此判定耐药细胞是否具有耐药性。

2.2生长曲线测定王金华等[25]建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OV1228/Taxol后，绘制细胞生长增殖曲线，根据Patterson公式，计算细胞在对数生长期的倍增时间。

2.3耐药倍数的检测用一种化疗药物诱导建立的多药耐药细胞系一般需要用同种、同类或不同种类的多种化疗药物检测细胞的敏感性以判定其MDR，耐药性一般用耐药倍数表示，实验常采用四甲基偶氮唑蓝法、磺酰罗丹明比色法检测。四甲基偶氮唑蓝法可用于检测加入不同药物后耐药细胞的敏感性和半抑制浓度、交叉耐药、计算耐药指数等[26]。检测细胞内荧光染料罗丹明123的积累变化，可用来对药物逆转肿瘤细胞多药耐药的活性进行评价[27]。光学显微镜、透射电镜对细胞形态及超微结构变化的观察，台盼蓝染色活细胞技术绘制生长曲线计算细胞倍增时间，Patterson法对细胞群体倍增时间计算，Hambur-Salmon法对集落生成率计算[28]，胰酶-姬姆萨G显带法进行染色体分析，染色体数平板克隆形成率，以上几种方法均可用于细胞耐药倍数的检测。

2.4耐药标志物的检测耐药标志物包括多药耐药蛋白及其他标志性恶性功能分子[29]。常见的耐药标志物有肿瘤多药耐药基因1产生的P糖蛋白[30]、MDR相关蛋白基因、腺苷三磷酸结合转运蛋白G超家族成员2(该蛋白与P糖蛋白都属于膜转运蛋白家族)、多药耐药相关蛋白2、Bax蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、拓扑异构酶Ⅱ、乳腺癌耐药蛋白以及肺耐药相关蛋白等。王金华等[25]在人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株 OV1228/Taxol的建立中发现，蛋白激酶C-a可能与肿瘤多药耐药基因1的表达相关。常用的检测耐药标志物的方法有实时荧光定量聚合酶连反应检测MDR基因信使RNA的表达，蛋白印迹法检测P糖蛋白的表达，基因芯片法检测信号通路的改变。

2.5耐药机制的检测MDR已成为肿瘤治疗的最大阻碍。肿瘤多药耐药机制包括以下几种：①耐药相关蛋白高表达，包括P糖蛋白、肺耐药相关蛋白、乳腺癌耐药蛋白以及多药耐药蛋白；②影响药物代谢；③影响药物作用的靶点；④细胞凋亡受抑。其中P糖蛋白与多药耐药的产生密切相关，该蛋白具有外排泵功能，其能使细胞内的药物浓度降低，使细胞毒药物在细胞内蓄积减少，最终导致抗癌效应丧失，这是耐药细胞产生耐药的重要途径之一。研究发现，凋亡受抑在肿瘤细胞耐药中有重要作用，其中存活蛋白是主要的凋亡抑制分子，主要表达于人未分化的成熟组织以及多种肿瘤细胞中[30]。肿瘤MDR的产生可能与DNA修复、蛋白激酶C、微管蛋白相关蛋白、体内激素、肿瘤血管形成以及线粒体凋亡方式等多种因素有关[31-32]。

3小结

在体外建立稳定的肿瘤多药耐药模型，对研究MDR的机制及逆转具有重要意义。一直以来，多位学者已成功建立了一系列的多药耐药体外模型，这些模型为进一步研究肿瘤耐药、提高化疗效果等奠定了基础。寻找能有效逆转MDR的逆转剂是当前肿瘤化疗亟待解决的难题，从天然资源中寻求高效、低毒、作用靶点广泛的耐药逆转剂已成为MDR研究的必然趋势和热点，相信在不久的将来研究者能够克服这些难题，使肿瘤得到很好的治疗。

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Methods and Evaluation of in vitro Multi-drug Resistance Tumor ModelQIAOTing-ting，PENGFang.(CollegeofPharmacyandChemistry,DaliUniversity，Dali671000,China)

Abstract:Setting up advantageous multi-drug resistant tumor model in vitro can provide guidance for clarify the multi-resistance related mechanism,and optimize the existing antitumor drug evaluation methods,provide references for reversion of multi-drug resistant tumor and the development of new antitumor drugs.Here introduces the modeling methods of multi-drug resistant tumor in vitro,analyzing and summarizing the intermittent shock method for large dose drug,the method of increasing drug concentration,large doses of discontinuous shock combined with concentration increasing method and genetically modification combined with drug screening method.

Key words:Tumor； Multi-drug resistant； Model； Evaluation

收稿日期：2014-10-29修回日期：2015-03-15编辑：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.023

中图分类号：R752.11

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)22-4093-03