电化学DNA生物传感器的指示方法及其临床研究进展

张　泽，万广财，王　娜，于洪伟(综述)，常　东(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院检验科，哈尔滨 150001)

电化学DNA生物传感器的指示方法及其临床研究进展

张泽△，万广财△，王娜△，于洪伟△(综述)，常东※(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院检验科，哈尔滨 150001)

摘要：电化学DNA生物传感器是很有前景的核酸分析技术，由于它操作简便快速、信号灵敏，能与DNA生物芯片兼容等优点，受到了广泛的关注，成为当今生物学、医学领域的前沿性课题。它利用杂交原理及电化学标志物为杂交检测信号，既可以用标记法又可以用非标记法进行检测，不受颜色影响，可对痕量样品测定，仪器设备易于集成化和自动化且价格低廉，正朝向便携式商业化方向发展。实现电化学DNA生物传感器的准确检测，实验中所用到的指示方法发挥很大作用。该文着重阐述在DNA传感器工作中所运用的指示方法以及其在临床中的研究进展。

关键词：DNA；电化学活性； 杂交

DNA生物传感器作为一种简单的检测特定DNA序列的方法引起了广泛的关注，通常情况下，通过与互补链杂交来检测特定DNA序列，杂交能引起信号转换器的变化，因此，捕捉杂交前后的信号变化来判断DNA杂交反应情况。电化学检测DNA的方法大多数需要一些标记元素，将杂交信息放大转化为可测的电化学信号，如氧化活性分子，它能对单链和杂交后的双链加以区分，标志物可以吸附于探针上[1]、检测链上或添加到溶液中[2]；还有一些无标记[3]的方法也被广泛应用，既可以依靠靶DNA的直接电化学特性，又可以依赖DNA杂交之后界面电性能的变化进行检测。因此，DNA电化学传感器的杂交指示方法是此类传感器的关键性问题，现主要介绍标记和非标记的DNA电化学检测方法及临床研究进展。

1有标记DNA电化学检测

有标记的方法主要是指通过吸附、化学修饰或生物亲和等把一些具有电化学活性或催化活性的无机或生物粒子等固定在DNA片段上，通过检测修饰粒子本身或其催化底物的信号来指示杂交过程。在电化学DNA生物传感器中，标记型杂交指示剂通常是典型的氧化还原活性分子，能插入双链DNA分子中，且不会对单链DNA造成很大影响；或者这些分子能优先绑定在单链或双链DNA上。也有一些已经报道的标记元素，如酶、纳米微粒、脂质体等。

1.1电化学活性物质DNA从灵活的单链DNA到相对僵硬双链DNA的变化可以用标记的方法检测，同样，也可以用非标记的方法检测。电活性DNA标志物是一类电活性较好的物质，它们通过化学键合作用直接或间接地连接在ssDNA链末端，制成带有标记的ssDNA探针。如二茂铁和亚甲蓝是电化学活性物质，是在DNA电化学生物传感器中常用的指示剂，将二茂铁标记到探针的末端，由于单链DNA相对灵活，可以使二茂铁更接近电极表面，因此可以被氧化还原。然而，杂交之后，双链DNA立于电极表面，增加了从电极到二茂铁的电子转移距离，使信号发生改变，变化的信号量与杂交程度呈现一定比例关系，因此，可以检测杂交量。与二茂铁相比，亚甲蓝稳定性较好，且在高浓度的氯化物中能更好地发挥作用。Lai等[4]进一步发展了这一实验方法，把茎环探针固定于金电极表面，茎环结构特点是它部分为自身杂交，使标志物亚甲蓝能更为贴近金电极表面，并且发出较好的电化学信号。

1.2酶在检测杂交反应中，常将具有氧化还原活性的酶标记在DNA探针上，利用酶的催化放大功能来进行间接测定的方法。当DNA探针与靶DNA杂交后，这些酶与其对应的底物发生催化作用，产生的电信号被用于靶DNA的分析。辣根过氧化物酶就是一种作为标志物的电化学指示剂，Zhang等[5]用电化学酶放大夹心法检测38个碱基的DNA序列，用辣根过氧化物酶标记于探针末端。通常检测探针会带有放射性的标记，或产生光学、电化学等标记。

1.3金属纳米颗粒纳米技术的出现为各个科学领域提供了新的发展前景。纳米微粒具有大比表面积、高活性、极微小性等特点，与传感器所要求的多功能、微型化相匹配。DNA探针标记有金属(常用的是金、银、铂)纳米颗粒，再与目标DNA杂交后，通过特定处理得到相应的电化学信号。以纳米金为例，它能迅速、稳定地吸附核酸、蛋白质等生物分子，而且这些生物分子的生物活性几乎不会发生改变，所以纳米金具有优良的生物相容性，可以作为生物分子的载体。金本身是非常优良的导电材料，具有优异的电化学性质，同时又具有较好的电活性，可作为电化学DNA传感器的杂交指示剂。Authier等[6]将纳米金应用到定量检测人巨细胞病毒，用金纳米探针与人巨细胞病毒的单链DNA(人巨细胞病毒 DNA)进行杂交反应，采用阳极溶出伏安法测定溶解得到的金离子，间接测定DNA含量。

1.4脂质体脂质体是一种球型的小囊泡，以水为中心，磷脂双分子层包绕而成[7-8]，脂质体的内部空穴可以用来贮存酶、蛋白、DNA、药物或其他物质[9]，形成有标记的脂质体，用于DNA的检测。对于脂质体的研究不断发展，已经从传统的小囊泡发展到通过调整脂质组成、大小和囊泡的量获得有长循环的第二代脂质体，脂质体的薄膜可以被各种生物活性物质修饰，以获得特效的活性，大部分脂质体膜修饰物有寡聚核苷酸链、抗体、蛋白受体、放射性标志物[10-12]等，鉴于脂质体的诸多优点，因此被用于电化学领域，达到扩大电化学信号的目的。目前的研究把脂质体看作是能树状放大DNA感应的微粒子构建元件，提供了一个骨架结构。Nejdl等[13]将Zn(Ⅱ)包裹于脂质体内，金纳米粒固定于脂质体外侧，该研究成功地说明脂质体适用于Zn(Ⅱ)和核酸的传送，未来可以用于靶定和控制肿瘤的转运，以及阻止病毒的繁殖。

2非标记DNA电化学检测

2.1DNA分子自身电化学活性相对于有标记的方法来说，非标记的方法有很多优势，它无需对DNA进行标记就能简单、快速地直接检测杂交反应，对DNA的活性或折叠等产生较小影响。目前，构建简单、低成本、无需标记的检测方法是DNA生物传感器的发展趋势。非标记的方法基于DNA本身的电活性或依赖于界面电性能的变化，即杂交后ss-DNA变为ds-DNA时引起的电极界面电性能改变。前者主要是指鸟嘌呤的电化学氧化的变化[14]，因为DNA分子本身具有一定的电活性，主要是由DNA碱基所引起，其中鸟嘌呤是最容易发生氧化反应的碱基，可以在大多数电极上产生氧化还原峰，再者由于它的简便性和多功能性，在非标记的方法中很受欢迎。Pantos等[15]将磺基水杨酸和单链DNA通过电聚合作用修饰到玻碳电极上，利用差分脉冲伏安法，非标记成功地同时检测腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。

2.2电活性小分子以非标记型电活性小分子杂交指示剂作为识别元素，它与双链DNA结合的能力强于单链DNA，单链DNA与电活性小分子之间为静电作用，而双链DNA是静电作用与内部疏水作用相结合，因此可以对两者进行区分。现在常见的染料杂交指示剂有亚甲蓝、灿烂甲酚蓝、吖啶酮衍生物等。亚甲蓝在标记型杂交指示剂中的应用，同样，也可以作为非标记型杂交指示剂的识别元素。Liu等[16]合成一种聚噻吩和亚甲蓝的混合物作为一种电化学DNA杂交指示剂，完全杂交后，亚甲基蓝功能化的聚噻吩使电流增加，相比单独的亚甲蓝指示剂，亚甲基蓝功能化的聚噻吩对缓冲液浓度的变化有更好的抵抗作用。亚甲蓝较为常用，本科研组也做过相关实验研究[17]。

2.3金属配合物金属配合物作为一种DNA靶向分子应用广泛[18]。它可以与DNA的碱基或磷酸骨架相结合，并且能嵌入到双链DNA的沟槽内，发生静电作用。王茂清等[19]将DNA探针固定于铂纳米颗粒的玻碳电极上，以邻菲咯啉合钴[Co(phen)3]3+作为杂交指示剂，用方波伏安法进行检测，杂交后信号变大。

2.4DNA分子小沟结合剂上述所说的电活性小分子和金属络合离子在非标方法中以嵌入剂的形式发挥作用，虽然它们无需标记过程，但是它们既可以与单链DNA结合，同时又能与双链DNA相结合。再者，它们易从双链DNA分子上脱落，电化学信号的检测受到影响，灵敏度降低。要使非标记检测方法更加灵敏可靠，杂交指示剂起到很重要的作用，DNA分子小沟结合剂与嵌入剂相似，但它与DNA分子结合方式和嵌入剂不同，它是与双链DNA的小沟相结合，而不是嵌入双链DNA分子碱基中，因此，选择性更加良好，这类物质有纺锤菌素、抗肿瘤抗生素CC-1065、博来菌素、二苯并酰亚胺类染料[20]。

2.5电化学阻抗法非标记方法被扩展到用电化学阻抗法检测[18,21-23]，该方法是检测从单链修饰的电极到杂交之后感应电流阻抗的变化，由于双链负电荷增加，电荷交换的阻力也随之增加，电化学阻抗法已经证实对于电极表面生物识别和有功能的生物材料特性方面是一种有效且敏感的方法。目前，电化学阻抗法已经用于导电聚合物或金纳米颗粒修饰的肽核酸/DNA生物传感器中[24-25]。

3临床研究进展

临床检验与其他一些化学检验或测量有所不同，首先是样品高度复杂，因为临床中的样本取自于患者本身，同时受到来自外界和自身的多种因素影响；其次，样本数量巨大，时效要求较高，因此发展和应用微量、简便、易自动化的方法是临床检验工作者一直寻求的。目前辅助临床诊断的一些检测方法需要经过相对较长的时间才能取得结果，然而，运用电化学生物传感器能在很大程度上缩短临床检测时间，提高临床检测的时效性。目前已研制出的可以检测血糖、尿酸、人绒毛膜促性腺激素、细菌毒素等的生物传感器。

许多遗传性疾病是由于基因的异常表达或基因序列突变引起的，虽然在过去的几年里，关于疾病诊断的试验和技术不断发展，但是对于基因相关疾病的早期诊断并不理想，电化学DNA传感器结合DNA杂交原理，能快速、准确地检测潜在的危险因素，是目前诊断基因相关疾病的热点。Mohan等[26]用电化学阻抗法以无标记的方法检测乳腺癌1号基因，杂交前后，阻抗图谱明显变化，检测限达1×10-17mol/L。

DNA生物传感器还可用于研究抗肿瘤药物的作用机制。Brett 等[27]用修饰有双链DNA的玻碳电极来研究盐酸米托蒽醌与DNA相互作用的机制，结果表明，盐酸米托蒽醌能破坏拓扑异构酶Ⅱ，从而抑制核酸合成，导致细胞死亡。

4展望

近年来，电化学生物传感器越来越备受关注，尤其是在寻找新的电极修饰材料、新的指示剂、新的检测方法方面可进一步提高传感器性能。电化学DNA生物传感器的指示方法无论是标记的方法还是无标记的方法，都有各自的优缺点，标记的方法虽然灵敏度较高，但是对探针的预处理易对DNA的活性或折叠等产生影响；无标记的方法虽然简化了实验过程，但是灵敏度不如标记的方法。因此，要加紧研究兼顾两者优点的电化学DNA生物传感器。

虽然电化学生物传感器的优点突出，但至今商品化程度还不高，其原因是电化学生物传感器存在一些不足。尽管如此，它的发展前景仍十分乐观，依托现在生物技术(如聚合酶链反应、酶联免疫吸附试验、芯片技术等)提升传感器的适应性和稳定性，制造出便携、快速、灵敏的生物传感器。未来生物传感器的发展方向如下：首先，实现传感器的小型化，使之便于携带，能满足床前采样的需求；其次，可以与其他检测方法相结合，提高灵敏度；最后，实现多样品多组分自动化检测，用一种标志物对多种组分进行检测，提高电极的检测效率。随着生物医学传感器的不断发展，它必将成为现代医疗设备的重要组成部分，在医疗卫生事业中发挥巨大作用。

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The Indicating Methods of DNA Electrochemical Sensor and Progress of Clinical ResearchZHANGZe,WANGuang-cai,WANGNa,YUHong-wei,CHANGDong.(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:DNA electrochemical biosensor is a very promising nucleic acid analysis technology,which is a novel and developing technique combining biochemical,electrochemical,medical and electronic techniques with the advantages of being simple,reliable, cheap,sensitive,selective for genetic detection and convenience for integration and microminiaturization,and has been a hot topic in the field of biochemistry and medicine.DNA electrochemical biosensor are commonly employed to detect specific sequences of DNA.The transduction strategies can be subdivided into two main categories,labeled and label-free approaches.At present,it is developing toward the direction of portable commercial devices.Here is to make a review of the the indicating methods of DNA biosensors and the research development in the clinical application.

Key words:DNA; Electrochemical activity; Hybridization

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-03-30编辑：伊姗

基金项目：国家自然科学基金(81273129)；黑龙江省自然科学基金(D201174)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.002

中图分类号：R-331

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)22-4036-03