免疫学方法在混合精斑检验中的应用

张金辉(综述),封　宇(审校)

(重庆警察学院刑事科学技术系，重庆 401331)

免疫学方法在混合精斑检验中的应用

张金辉※(综述),封宇(审校)

(重庆警察学院刑事科学技术系，重庆 401331)

摘要：作为最常见的人体斑痕类型之一的精斑是法医物证检验的重要步骤，其确认往往是性侵犯案件定性的最重要证据之一，对混合精斑进行分离确证也是证物检验中的难点之一。传统的精斑检测主要依靠精子镜检、组织化学方法等方法，但是存在明显的不足之处。近年来，随着生物分子水平的迅速发展，抗原抗体反应及基因组学在精斑鉴定的法医实践中得到了应用。

关键词：免疫学方法；混合精斑；检验；应用

精斑是精液浸润或附着于基质上，干燥后形成的斑痕，主要由精子及精浆组成，是一种含蛋白质、各种酶及果糖等多种成分的碱性乳白色胶状液体。精斑是强奸案等性犯罪最重要的证据之一，对案件性质的确定具有重要的决定性作用。其检测方法主要有精子镜检、组织化学方法及免疫学方法等，各种方法各有优缺点和适用的范围[1]。免疫学方法是指运用抗原抗体反应的原理，特异性地对混合精斑进行确认的方法。由于免疫学方法具有操作简单、快速、经济等优点，已广泛地应用于混合精斑的检验。现对免疫学方法在混合精斑检验中的应用进行综述，以期为相关研究提供参考。

1抗前列腺特异性抗原胶体金免疫试纸条

又称精斑试纸条，是利用免疫学方法，如免疫电泳、斑点分子杂交法、斑点免疫结合、酶联免疫吸附试验等和色谱层析技术如薄层免疫测定等对前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)(P30)进行特异性检测的一种简便方法[2]。前列腺特异性蛋白是一种由前列腺分泌的人精液所特有的具有抗原性的糖蛋白，对其进行检测已成为确证精斑最有效的方法之一，尤其是对微量陈旧检材。该方法具有操作简单、经济、快速、特异性强、灵敏性高、结果易判读以及没有特殊设备要求等诸多优势，因此广泛地应用于法医学的实际精斑确证试验检案中。抗P30胶体金免疫试纸条是目前我国法医学检案中最常用的确证精斑的手段。有研究指出，对于浓度稀释至6000倍的精液，采用精斑确证试验获得的阳性结果依然是比较可信的[3]。为了更加方便、简单、快速地应用该免疫层析技术，使其拥有更大的优势，目前已经有大量成熟的快捷精斑试纸条投放入市场供使用。一般的试纸条的其灵敏度即可达4000～6000倍，还有的可以精确到万倍以上[4]。由于厂家的不同，所生产出来的产品在敏感性上也存在差异。临床上主要的商用试剂条有Bioengine、Chembio、Medpro、SPERM HY-LITER、One Step ABA card、Onco-screen、Seratecl PSA Semiquant和PSA check-1等[5]。在实际应用中，除了规范操作步骤外，还要避免假阳性的出现。各种具体的实际情况都可能会影响到其精确度和敏感性，如检测时精斑浸液过浓、时间过长、遭水洗破坏、种属之间发生交叉反应等，均有可能使结果出现假阴性现象[6-7]。另外，文献报道，浓度在6.4%以上的NaCl溶液可能会使该反应产生假阳性反应。可见，传统的精斑确证方法在多个方面(敏感性、特异性、实用性)等均存在着一些缺陷，有必要对其进行优化改进。

2信使RNA

个体一般存在两种不同类型的基因，一种为管家基因，广泛存在于所有组织中的细胞，负责细胞功能的维持。另一种基因称为非管家基因，指专一性地表达于特定组织，比如人体的淋巴细胞、白细胞和阴道上皮细胞、精子等终末分化细胞的形成就由这种特定基因的关闭或开启决定[8]。RNA在不同功能和不同类型的组织或细胞中的表达模式存在差异。如果对斑痕的信使RNA(mRNA) 的种类进行分型确定，就可以识别其组织来源。mRNA检测的步骤通常如下：首先采用Trizol法对样本RNA进行提取和收集，接着用 DNase I对mRNA 进行消化，加入逆转录所需要的核苷酸分子后，逆转录合成互补DNA，最后采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪进行PCR扩增，得到大量的产物及对产物进行测序等[9]。由于RNA 酶广泛存在于细胞和环境中，离体后被迅速降解，故一般认为mRNA 是极其不稳定的，不可能作为理想的法医分子标记。但随着医学技术的发展，RNA在干燥斑痕中的稳定性得到证实。而且基因组和逆转录PCR技术的广泛应用也使RNA作为法医证据检测方法得到实现。但是在实际应用中，仍然需要谨慎的对待逆转录PCR 出现的实验阴性结果，因为 RNA稳定性远远比不上DNA，各种不适应的保存环境、对RNA提取及逆转录的过程中操作不当均容易导致 mRNA 的降解，进而出现阴性结果。可以说，利用组织特异性RNA进行斑痕检测已经成为目前法医学科斑痕标记研究的热点之一[10]。

自1989年Pessot等[11]首次在实验室对成熟精子mRNA 进行检测以来，已经有很多实验室开展相关的研究。Bauer和Patzeh[12]于2003年首次证明，成熟精子的核蛋白鱼精蛋白1 和2是特异性的精子标志物，对包括血液、阴道拭子、唾液和人体组织等不含精子的样本的鱼精蛋白1和鱼精蛋白2检测均呈阴性，表明核蛋白鱼精蛋白1和鱼精蛋白2适合作为精子的标志物。2006年，Nussbaumer等[13]采用逆转录实时荧光定量PCR技术通过mRNA检测进行了体液斑鉴定的研究。2008年，Haas等[14]采用与精子标志物鱼精蛋白1 和 鱼精蛋白2对放置15个月的精斑进行检测，检出结果为阳性。此后，越来越多的基于检测mRNA的体液斑确证方法研究陆续被报道出来。

相对传统精斑确证试验而言，利用mRNA进行精斑标记具有特异性强、敏感性高、干扰少、检测结果可靠等优点。但mRNA的检测需要用到PCR扩增仪等比较大型的仪器，只能在特定的实验室操作完成，需要经过专门培训的实验人员，消耗的耗材也相对比较昂贵，而且mRNA也比较容易酶解，这一定程度上也限制了其应用。

3微RNA

微RNA(microRNA，miRNA)是一种长度为18～23 nt的单链非编码小分子RNA，由具有发夹结构且长度为70～90 nt的单链RNA前体经过Dicer酶切后生成[15]。Hanson等[16]指出，mRNA一般其扩增产物长度比较长，容易断裂，具有一定的缺陷。他们在451个miRNA基因座中筛选出9个在某一种体液中表达较高而在其他体液中不表达或表达较低的miRNA标记(miR-10b、miR-16、miR-124a、miR-135b、miR-205、miR-372、miR-412、miR-451和miR-658)，其中2个标记成功(miR-10b及miR-135b)应用于精斑的检测。此后有许多具有组织特异性的miRNA被相继识别。

4DNA甲基化

随着后基因组时代的到来，法医DNA分析技术在法医鉴定中的作用越来越重要。DNA甲基化由于其具体的特异性和稳定性已经成为目前最为理想的法医分子标记[17]。DNA 甲基化主要是指DNA复制后主要在CpG二核苷酸的胞嘧啶上进行共价修饰而成的核酸。这种修饰不改变 DNA 的序列，但可以对基因的表达进行调控。在分化的体细胞，基因组甲基化模式通常是稳定、可遗传的[18-19]。组织之间广泛存在的甲基化差异位点理论上均可以作为候选的斑痕标记。DNA 甲基化的发现为研究者在 DNA 水平进行斑痕鉴别提供了可能。2005年，赵贵森和杨庆恩[20]首次提出了根据 DNA 甲基化进行法医组织斑痕鉴别的思路。2012年，刘峰等[21]采用DNA IQTM System试剂盒成功检验了1例精斑。随着技术的不断改进，已经有越来越多的采用DNA甲基化原理的试剂盒被应用到精斑的检测中[22-24]。DNA甲基化由于其稳定的理化性质，以及高敏感性、高特异性等优点，越来越显示出具有广阔应用前景的新型分子标记。

5免疫磁珠技术

通过将特异性的抗体与磁性微球进行偶联，利用磁性分离技术，可达到对精阴混合斑中精子进行捕获和检测。免疫磁珠技术具备其他方法所缺少的固相化试剂的优点。目前，精子特异性抗原对应的单克隆抗体及多克隆抗体已经有商品化的试剂可以购买，同时免疫磁珠结合配基的技术发展也已经十分成熟。2007年Anslinger等[25]针对精子表面的血管紧张素转换酶抗原筛选出3种抗体1E10、4E3和4E10制备免疫磁珠，并且成功进行了分离。2011年国内学者也对该技术进行了初步研究，利用人精子鱼精蛋白抗体和抗SPAG8抗体成功对精子细胞进行的捕获和分离。可以说，免疫磁珠技术由于具备了抗原抗体的高特异性和其本身固有的固化性，具有较好的法医学应用前景[26]。

6其他

精液特异性抗原可被单克隆抗体MHS-5(精囊腺上皮细胞分泌的特异蛋白质)识别，其具有很高的灵敏度，但是特异性不如PSA试验，现在已经很少使用。其他用于精液检测的抗原主要有单克隆抗体1E5、精液凝固蛋白 Ⅱ、19-OH F1a/F2a前列腺素等。

7小结

精斑是法医实践中常见的物证检材。在强奸、猥亵等案件中，对精斑的检验可以为案件的侦查提供线索，为分析、审理案件提供证据。随着犯罪手法的日益复杂，对微量精斑鉴别提出了更高的技术要求。传统的镜检精斑已经无法满足法医学的需求。应用免疫学原理，在核酸分子水平进行的精子特异性的分子标记，高度灵敏、特异、结果可靠，有望成为未来进行斑痕确证的主要方法。但是，利用核酸分子水平进行精斑鉴别目前还不是很成熟，还处于起步阶段，进行法庭提供证据，还需要辅助采用其他较为成熟的检验方法。

参考文献

[1]Nakanishi H,Hara M,Takahashi S,etal.Evaluation of forensic examination of extremely aged seminal stains[J].Leg Med(Tokyo),2014,16(5):303-307.

[2]刘海渤,冯保强,陈雪云,等.改良PSA检测法在精斑检验中的应用[J].昆明医科大学学报,2013,34(1):157-159.

[3]李慧,姚亚飞.性侵犯案件中对于精斑试纸条使用灵敏度以及特异性的研究[J].法制与社会,2012,13(9):258-259.

[4]范光耀,赵贵森.精斑鉴别技术研究进展[J].中华男科学杂志,2010,16(8):735-740.

[5]Miller KW,Old J,Fischer BR,etal.Developmental validation of the SPERM HY-LITERTMkit for the identification of human spermatozoa in forensic samples[J].J Forensic Sci,2011,56(4):853-865.

[6]Jänisch S,Meyer H,Germerott T,etal.Analysis of clinical forensic examination reports on sexual assault[J].Int J Legal Med,2010,124(3):227-235.

[7]余家树,覃开良,龚丽君,等.精斑检验干扰因素的研究[J].刑事技术,2002(5):17-19.

[8]Fleming RI,Harbison S.The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids[J].Forensic Sci Int Genet,2010,4(4):244-256.

[9]Ruijter JM, Lorenz P, Tuomi JM,etal.Fluorescent-increase kinetics of different fluorescent reporters used for qPCR depend on monitoring chemistry,targeted sequence, type of DNA input and PCR efficiency[J].Mikrochim Acta,2014,181(13/14):1689-1696.

[10]许炎,张晨,徐庆文,等.应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性[J].法医学杂志,2013,29(4):259-262.

[11]Pessot CA,Brito M,Figueroa J,etal.Presence of RNA in the sperm nucleus[J].Biochem Biophys Res Commun,1989,158(1):272-278.

[12]Bauer M,Patzeh D.Protamine mRNA as molecular marker for spermatozoa in semen stains[J].Int J Legal Med,2003,117(3):175-179.

[13]Nussbaumer C, Gharehbaghi-Schnell E, Korschineck I.Messenger RNA profiling: a novel method for body fluid identification by real-time PCR[J].Forensic Sci Int,2006,157(2/3):181-186.

[14]Haas C,Mtdeim C,Kratzer A,etal.mRNA profiling for the identification of sperm and seminal plasma[J].Forensic Sci Int Genet Suppl,2009,2(1):534-535.

[15]景花,宋沁馨,周国华,等.MicroRNA定量检测方法的研究进展[J].遗传,2010,32(1):31-40.

[16]Hanson EK,Lubenow H,Ballantyne J.Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs[J].Anal Biochem,2009,387(2):303-314.

[17]张璐.微量DNA检验技术及应用——微量DNA检验技术及展望[J].警察技术,2012,4(2):3-6.

[18]凡时财,张学工.DNA甲基化的生物信息学研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2009,36(2):143-150.

[19]喻少波,许飞.混合斑检材中极微量精子DNA检验初探[J].警察技术,2012,4(2):18-19.

[20]赵贵森,杨庆恩.DNA 甲基化标记法医学应用探讨[J].法医学杂志,2005,21(1):61-64.

[21]刘峰,李栽儿,尹路,等.DNA IQTM System试剂盒用于精斑检验1例[J].中国法医学杂志,2012,27(3):257.

[22]李栩文,于兆新,罗俊,等.国产Goldeneye20A试剂盒在精斑DNA检测中应用[J].河南科技大学学报:医学版,2012,30(4):271-272.

[23]郭磊,王燕,姜伯玮,等.PuriTyperTM法医学纯化试剂盒的性能验证[J].中国法医学杂志,2012,27(1):32-34.

[24]周如华,石云杰,周钱颖,等.改良EVO150-8方法在DNA自动化检案中的应用[J].中国法医学杂志,2011,26(6):468-469.

[25]Anslinger K,Bayer B,Danilov SM,etal.Application of sperm-specific antibodies for the separation of sperm from cell mixtures[J].Forensic Science International:Genetics Supplement Series,2008,1(1):394-395.

[26]赵兴春,姜伯玮.精子细胞定向捕获与分离技术初步研究[J].刑事技术,2012(1):14-17.

The Application of Immunological Method on the Identification of Mixed Seminal StainsZHANGJin-hui,FENGYu.(DepartmentofCriminalScienceandTechnology,ChongqingPoliceAcademy,Chongqing401331,China)

Abstract：The authentication of seminal stains is one of the important means in forensic tests.Being one of the most important decisive evidence among the crimes of rape,the authentication of mixed seminal stains is usually enormously difficult.Traditional identification of seminal stains mainly relies on the microscopic identification of spermatozoa,histochemical method,which still have defects.With the development of biological molecular level,antigen antibody reaction and genomics have been applied to semen stain identification.

Key words：Immunology; Mixed seminal stains; Identification; Application

收稿日期：2015-01-12修回日期：2015-04-24编辑：相丹峰

基金项目：重庆市公安局科技攻关计划项目(2012-10)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.007

中图分类号：R331； R89

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)22-4051-03