HPLC法同时测定侧柏叶、侧柏炭中的7种成分

谭晓亮， 李瑞海

（1.沈阳市中医院，辽宁沈阳100020；2.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

HPLC法同时测定侧柏叶、侧柏炭中的7种成分

谭晓亮1， 李瑞海2*

（1.沈阳市中医院，辽宁沈阳100020；2.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

目的 建立HPLC法同时测定侧柏叶、侧柏炭中杨梅苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮的含有量。方法 侧柏叶、侧柏炭提取液的分析采用Welch Ultimate LP-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱；检测波长330 nm；体积流量1 mL/min。结果 杨梅苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮的标准曲线均呈良好的线性关系 （r＞0.999 5），平均回收率为97.6%～101.1%，RSD＜1.14%（n=6）。结论 该方法简便易行，可用于侧柏叶、侧柏炭的含有量测定。

侧柏叶；侧柏炭；杨梅苷；槲皮苷；杨梅素；槲皮素；山柰酚；穗花杉双黄酮；扁柏双黄酮；HPLC

侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和叶，具有凉血止血、化痰止咳、生发乌发等作用，可用于治疗吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺热咳嗽、血热脱发、须发早白［1］等症状。本课题组前期研究发现，侧柏叶的主要成分除药典规定的槲皮苷外，还含有杨梅苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮等黄酮类化合物，但目前尚未有关于同时测定侧柏叶中这7种成分的报道。因此，本实验采用高效液相色谱（HPLC）法，并利用甲醇-磷酸水溶液系统梯度洗脱，建立同时测定侧柏叶中7种黄酮类成分的方法，然后测定不同产地侧柏叶、侧柏炭药材中这些成分的含有量。由于目前普遍认为中药是以多组分协同而起效，因此本实验所

建立的多指标含有量测定方法对药材质量的控制具有实际意义，为制定合理的侧柏叶质量控制方法和进一步的相关研究奠定基础［2-9］。

1 实验仪器与材料

P230IIUV230II紫外检测器、EC2006-色谱数据处理工作站 （大连依利特分析仪器有限公司）；KQ3200超声波清洗器 （昆山超声仪器有限公司）；电子天平 （十万分之一，德国赛多利斯公司）。槲皮苷 （批号 111538-200504）、槲皮素 （批号10081-00901）对照品 （中国食品药品检定研究院）；杨梅苷 （批号20130528）、杨梅素 （批号20130619）、山柰酚 （批号20130623）、穗花杉双黄酮 （批号 20130713）、扁柏双黄酮 （批号20140112）对照品 （大连美仑生物技术有限公司，纯度均＞99%）。HPLC用水为重蒸馏水；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。侧柏叶、侧柏炭经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定，均为柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和叶，药材具体来源见表1。

2 实验方法与结果

2.1 含有量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取各对照品适量，加甲醇溶解，分别制成含杨梅苷 0.032 mg/mL、槲皮苷0.051 mg/mL、杨梅素0.006 1 mg/mL、槲皮素0.008 2 mg/mL、山柰酚0.007 1 mg/mL、穗花杉双黄酮0.065 mg/mL、扁柏双黄酮0.047 mg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取药材粉末0.2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件 Welch UltimateLP-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇 （A）-0.2%磷酸水溶液 （B），梯度洗脱 （0～8 min， 32%A；8～15 min，32%～62%A）；检测波长330 nm；体积流量1 mL/min；柱温35℃；进样量20μL。

2.3 专属性试验 精密吸取对照品、供试品溶液各20μL，在 “2.2”项色谱条件下进行测定。结果，7种对照品的分离度均良好，而且与供试品中其它成分不干扰，见图1。

图1 对照品、侧柏叶和侧柏炭的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances，Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum

2.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取7种对照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，甲醇溶解，定容于10 mL量瓶中，注入HPLC色谱仪，在“2.2”项色谱条件下测定峰面积，以对照品进样量 （μg）为横坐标 （X），峰面积为纵坐标 （Y）绘制标准曲线，结果见表2。

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液20 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果，7种对照品峰面积RSD值分别为0.83%、1.00%、0.50%、0.60%、0.62%、0.82%、0.77%，说明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取侧柏炭样品 （江苏南京产）6份，按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并在“2.2”项色谱条件下进行HPLC分析。结果，7种对照品峰面积RSD值分别为1.30%、0.82%、1.00%、1.01%、0.88%、0.31%、0.78%，说明该方法重复性良好。

表2 7个黄酮类化合物的回归方程Tab.2 Regression equations of seven flavonoids

2.7 稳定性试验 取侧柏炭样品 （江苏南京产）适量，在 “2.2”项色谱条件下，于0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果，7种对照品峰面积RSD值分别为 0.79%、1.36%、1.24%、0.51%、1.37%、1.17%、1.44%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收试验 精密称取侧柏炭样品 （江苏南京产）6份，每份0.2 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入含杨梅苷0.032 mg/mL、槲皮苷0.051 mg/mL、杨梅素0.006 1 mg/mL、槲皮素0.008 2 mg/mL、山柰酚0.007 1 mg/mL、穗花杉双黄酮0.065 mg/mL、扁柏双黄酮0.047 mg/mL的对照品溶液1 mL，按 “2.1.2”项下方法制备，在“2.2”项色谱条件下进行HPLC分析，计算回收率。结果，7种对照品的平均加样回收率分别为98.5%、99.2%、101.0%、100.0%、102.4%、101.2%、99.3%，RSD 值分别 为 0.89%、0.98%、 1.74%、 0.74%、 1.00%、 1.15%、0.71%，符合相关规定，回收率良好。

2.9 侧柏叶、侧柏炭中7种成分含有量测定 分别吸取各供试品溶液20μL，在 “2.2”项色谱条件下测定，记录各供试品中7种对照品的色谱图，再采用外标两点法，依据标准曲线回归方程进行含有量计算，结果见表3。

表3 不同产地侧柏叶、侧柏炭中7种对照品的含有量 （mg/g）Tab.3 Con tents of seven flavonoids in Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum in different grow ing areas（mg/g）

3 小结与讨论

本实验比较了330 nm和254 nm这两种波长，发现330 nm处色谱峰的数目较多，而且分离效果良好，基线较平稳，故选用 330 nm作为检测波长［10］。

本实验曾参考药典中卷柏和侧柏叶的提取方法，比较 “加热回流5 h”和 “超声处理30 min”在两种方法，发现两者提取效果相当，考虑到后者提取速度更快，故选用 “超声处理30 min”作为提取方法。

不同产地的侧柏叶中均检出杨梅苷、槲皮苷、杨梅素、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮，但目前药典仅以槲皮苷成分来评价其质量，因此不够全面客观。实验发现，不同产地的侧柏叶还含有许多穗花杉双黄酮成分，而且某些产地其含有量比槲皮苷还高。因此，以多组分为指标来进行中药质量评价更

具有客观意义。

另外，不同产地的侧柏炭中均检出杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮、杨梅素、槲皮素、山柰酚，并且前四种成分的含有量均比侧柏叶低 （但不能确定侧柏炭是否是同一批次侧柏叶炮制而成），同时还出现了生品没有的槲皮素、山柰酚等色谱峰，提示侧柏叶经炮制后，可能存在黄酮成分转化的过程，其机制有待于作进一步研究。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［2］ 于祝婷，单鸣秋.侧柏叶不同物候期槲皮苷含量动态积累研究［J］.中国现代中药，2011，13（2）：35-36.

［3］ 吴怀恩，甄汉深，韦志英，等.RP-HPLC法同时测定侧柏叶炭中槲皮素和山柰素的含量［J］.中国药房，2009，20（12）：934-935.

［4］ 黄樱华，黄月纯，魏 刚，等.正交试验法筛选侧柏叶总黄酮的提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15（11）：34-37.

［5］ 单鸣秋，高 静，丁安伟.超高效液相色谱法测定侧柏炭中5个黄酮类成分［J］.中草药，2011，42（2）：282-284.

［6］ 于 生，单鸣秋，丁安伟，等.侧柏叶炮制前后总黄酮的含量变化［J］.现代中药研究与实践，2010，24（1）：51-54.

［7］ 申卫红，张子龙，叶家宏，等.侧柏叶及其水煎液HPLC特征图谱的相关性研究［J］.中药新药与临床药理，2013，24（5）：487-490.

［8］ 吴怀恩，甄汉深，韦志英，等.侧柏叶不同炮制品中槲皮苷与槲皮素的含量测定［J］.时珍国医国药，2009，20（2）：354-356.

［9］ 曹 园，吴永平，周晓雯，等.HPLC同时测定卷柏药材中炔多酚和双黄酮的含量［J］.中国中药杂志，2012，37（9）：1254-1258.

［10］ 刘海青，林瑞超，冯 芳，等.HPLC法测定卷柏类药材中双黄酮成分的含量［J］.药物分析杂志，2002，22（5）：392-395.

Sim ultaneous determ ination of seven constituents in Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum

TAN Xiao-liang1， LIRui-hai2*

（1.Shenyang Hospital of Traditional ChineseMedicine，Shenyang 1OOO2O，China；2.Collegeof Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 1166OO，China）

AIM To establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of myricetrin，quercitrin，myricetin，quercetin，kaempferol，amentoflavone and hinokiflavone in Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum.METHODS The analyses of C.Platycladi and C.Platycladi Carbonisatum extracts were performed on Welch Ultimate LP-C18column（4.6 mm×250 mm，5μm），mobile phasewasmethanol-0.2%phosphoric acid aqueous solution in a gradient elution mode，detection wavelength was set at330 nm，and flow rate was 1 mL/min.RESULTS The standard curves of myricetrin，quercitrin，myricetin，quercetin，kaempferol，amentoflavone and hinokiflavone had good linear relationships（r＞0.999 5），whose average recoverieswere 97.6%-101.1%with RSD＜1.14%（n=6）.CONCLUSION Thismethod is simple and feasible，which can be used for the content determination of Cacumen Platycladi and Cacumen Platycladi Carbonisatum.

Cacumen Platycladi；Cacumen Platycladi Carbonisatum；myricetrin；quercitrin；myricetin；quercetin；kaempferol；amentoflavone；hinokiflavone；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2715-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.030

2015-04-01

谭晓亮 （1973—），男，主管中药师，从事药物制剂方面研究。Tel：（024）23899307，E-mail：409928912@qq.com

*通信作者：李瑞海 （1973—），男，博士，副教授，硕士生导师，从事药物制剂方面研究。Tel：（0411）85890183，E-mail：1801517231@qq.com