HPLC法检测60Co辐照对乌金丸有效成分的影响

李艳萍， 曾煦欣， 谢燕婷， 谭 珍， 莫金玉， 吴剑峰*

（1.佛山科学技术学院医学院，广东佛山528000；2.佛山冯了性药业有限公司，广东佛山528000）

HPLC法检测60Co辐照对乌金丸有效成分的影响

李艳萍1， 曾煦欣1， 谢燕婷1， 谭 珍2， 莫金玉1， 吴剑峰1*

（1.佛山科学技术学院医学院，广东佛山528000；2.佛山冯了性药业有限公司，广东佛山528000）

目的 考察不同剂量60Co辐照 （0、2、6和10 KGy）对乌金丸 （当归，益母草，香附，白芍，川芎等）有效成分的影响。方法 采用HPLC法检测乌金丸中阿魏酸和芍药苷辐照前后的含有量变化，所得结果利用SPSS 18.0进行统计学分析。结果 阿魏酸在0、2、6和10 KGy的辐照剂量下，含有量分别为0.92、0.90、0.90和0.89mg/g；芍药苷分别为1.76、1.83、1.78和1.78 mg/g。统计学分析发现，阿魏酸与芍药苷的含有量与辐照前相比，无显著性差异 （P＞0.05）。结论60Co辐照灭菌对乌金丸有效成分的含有量无影响。

乌金丸；阿魏酸；芍药苷；60Co辐照灭菌；HPLC

药品安全是重大民生和公共安全问题，中成药原料复杂，制备工艺繁琐，对于维持其质量、安全性及药效的稳定方面是一个极大的挑战，在其生产环节中以灭菌问题最为突出。辐照技术作为一项新兴的绿色加工技术，广泛应用于食品的防腐保鲜、化学、生物方面等［1-2］，与传统的食品保藏方法、加热、冷藏、化学处理等相比，具有杀虫灭菌彻底，不破坏食品结构和营养成分，不破坏原有包装，无污染等显著特点符合中药现代化生产规律，是近年来中药材原料与中成药灭菌的常用方法。早在1992年，就有文献报道，在100万伦以下剂量照射，对中成药、中药材的色、香、味与未照射的比较，无显著的差异［3］。但60Coγ辐照灭菌会引起个别中药的化学成分、生物活性变化［4］，如白芍、天麻、红花等均有成分发生改变的报道。《中国药典》2010年版规定，只有不受辐射破坏的原料药

及成品等才可用本法灭菌，60Coγ辐照灭菌应事前验证所使用的剂量不影响被灭菌物品的安全性、有效性及稳定性［5］。

乌金丸属于经典广东佛山地区传统中成药（当归20 g，益母草320 g，香附120 g，白芍60 g，川芎60 g，延胡索60 g，补骨脂20 g，吴茱萸20 g，小茴香20 g，艾叶20 g，莪术20 g，蒲黄20 g，木香20 g，三棱20 g，熟地黄20 g，百草霜14 g，将以上16味中药粉碎成细粉，混匀，过筛，每100 g粉末加炼蜜170～190 g制得），主治气滞血瘀所致之胸胁刺痛或产后小腹瘀痛拒按，或痛经等症。近年，乌金丸通过60Coγ射线辐照的灭菌方法使其微生物限量得以有效控制，但对于辐照灭菌是否造成有效成分辐解以及生物活性、安全性改变，至今尚未有定论，同时也缺乏相应的评价标准。本实验应用HPLC法考察60Co辐照对乌金丸有效成分阿魏酸和芍药苷的影响，为其进行辐照灭菌提供一定的基础研究数据。

1 仪器与材料

Agilent-1260高效液相色谱仪；Agilent-1260MWD检测器；Agilent TC-C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；法国赛多利斯BS-110S电子分析天平；AS5150B超声波清洗器；ZTLH00005纯水系统；移液枪。阿魏酸 （批号0773-9910，中国药品生物制品检定所），芍药苷对照品 （批号110736-201337，中国食品药品检定研究院）。乌金丸药材为佛山冯了性药业有限公司提供。乙腈和甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品制备 精密称取阿魏酸对照品置棕色量瓶中，用50%甲醇溶解，质量浓度为65μg/mL，低温保存。精密称取芍药苷对照品置棕色量瓶中，用50%甲醇溶解，质量浓度为320μg/mL，低温保存。

2.2 供试品制备 供试品的辐照工作由佛山冯了性药业有限公司完成。世界卫生组织认为，10 KGy及以下剂量对食品的辐照无需作毒理试验，因此高剂量选择10 KGy。本实验选择2、6、10 KGy共3个辐照剂量。乌金丸粉末 （过三号筛）分别在上述剂量下进行辐照，不经辐照处理的粉末作为空白 （0 KGy），即得所有供试品粉末样品。

取供试品粉末4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，遮光密塞，称定质量，超声提取30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀后滤过，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；阿魏酸流动相为乙腈-0.1%磷酸 （15：85），检测波长为320 nm；芍药苷流动相为乙腈-水 （15：85），检测波长为230 nm；两者体积流量均为1.0mL/min；进样量均为20μL；柱温均为40℃。

2.4 专属性试验 按 “2.3”项下色谱条件，将阿魏酸与芍药苷对照品溶液和供试品溶液分别进样，结果见图1。可见供试品中成分与对照品阿魏酸与芍药苷的出峰时间一致，供试品中两者的分离效果均较理想。

2.5 系统适应性试验 按 “2.3”项下色谱条件，分别对供试品和对照品溶液进行系统适应性考察，结果如表1所示。阿魏酸和芍药苷的理论塔板数和分离度均达到定量检测限要求。

表1 系统适应性结果Tab.1 Resu Its of system suitabiIity

2.6 线性关系考察 将阿魏酸和芍药苷对照品溶液分别用50%甲醇稀释，得到6个不同质量浓度，按 “2.3”项色谱条件考察线性关系，以峰面积对质量浓度进行线性回归。阿魏酸线性方程为y= 90.042x+9.039 3，r2=0.999 5；芍药苷线性方程为y=24.158x-0.208 6，r2=0.999 7。结果表明，阿魏酸在4.62～65μg/mL，芍药苷在20～320 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验 分别取阿魏酸和芍药苷对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果表明，阿魏酸和芍药苷的峰面积平均值RSD分别为0.92%和1.3%，表明仪器的精密度良好。

2.8 回收率试验 精密量取已知两成分含有量的乌金丸供试品（0 KGy）溶液9份，每份4mL，分别精密加入芍药苷 （500μg/mL）对照品溶液2 m L、1 mL和0.5 mL（即相当于样品中芍药苷含量的200%、100%和50%），然后甲醇定量至10 mL。另外精密量取上述供试品 （0 KGy）溶液9份，每份5 mL，分别精密加入阿魏酸 （64 μg/mL）对照品溶液0.8 mL、0.4 mL和0.2 mL（即相当于样品中阿魏酸量的200%、100%和

50%），然后甲醇定量至10 mL。以上溶液按“2.3”项下色谱条件进样含有量测定，计算平均加样回收率。结果如表2所示。供试品阿魏酸和芍药苷的平均回收率及RSD分别104.4%、2.5%、97.3%、2.9%。阿魏酸和芍药苷的平均回收率均达到97%以上，并且RSD都小于3%，表明方法准确度良好。

图1 对照品与供试品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chrom atogram s of reference substances and sam p Ies

表2 加样回收实验结果Tab.2 Resu Its of recovery tests

2.9 样品测定 将 “2.2”项制备的0、2、6和10 KGy辐照剂量的供试品进行色谱检测，平行操作3次，采用 “2.6”项下的回归方程分别计算供试品中阿魏酸和芍药苷的含有量，结果如表3所示。

表3 样品中阿魏酸和芍药苷含有量Tab.3 Contents of feru Iic acid and paeonifIorin in sam p Ies

2.10 统计学分析 使用SPSS 18.0软件单因素分析（One-way ANOVA）对“2.9”项下测定数据进行分析，以考察不同辐照剂量组之间的成分含有量差异是否具有统计学意义。结果见表4。阿魏酸和芍药苷的P值均大于0.05，表明组间均数的差异不具有统计学意义，即这两种成分经不同剂量60Co辐照后含有量变化没有差异，辐照灭菌不影响它们的含有量。

表4 单因素分析结果Tab.4 Resu Its of One-way ANOVA

3 讨论

3.1 指标成分的选择 《中国药典》未记载乌金丸辐照灭菌的质量检测标准。目前，应用较广泛的中药质量评价方法是对已知的几个主要成分或有效成分作为指标成分予以检测控制［6］。从乌金丸的处方分析可知，当归具有补血活血、止痛、润肠等功效，是乌金丸中的君药，其主要有效成分阿魏酸具有扩张血管、改善微循环、提高机体免疫力等作用［7］。处方中川芎的主要有效成分也是阿魏酸。因本品为大蜜丸，处方复杂，干扰严重，另一君药益母草无法获得较好的液相色谱图［8］，故不选择作为指标成分检测。而白芍作为本品的臣药，其有效成分芍药苷具有抗菌养血作用，在方中发挥重要作用。因此本实验选择阿魏酸和芍药苷作为指标成分，参照相似中成药 （十二乌鸡白凤丸）检测方法文献［9-10］，应用HPLC法对其成分进行定量测定，以考察60Co辐照对乌金丸有效成分的影响。

3.2 提取溶剂的选择 供试品分别用50%甲醇和纯甲醇提取作比较。实验结果表明，用50%甲醇作为溶剂时，芍药苷的峰面积明显比用纯甲醇提取的大，而这两种溶剂下阿魏酸的峰面积没有差别。因此选择用50%甲醇为供试品提取溶剂。

3.3 样品的保存 阿魏酸不稳定，见光、加热均易分解［11］，所以在配制对照品和供试品溶液时采用棕色量瓶，超声溶解时水浴温度控制在30℃以下，相关操作在避光条件快速进行［12］。芍药苷是白色吸湿性无定形粉末，溶液长时间暴露在空气中，含有量会有所降低。因此，本实验的对照品和供试品溶液均避光密封低温保存。

4 结论

本实验应用HPLC法考察不同剂量60Co辐照（0、2、6、10 KGy）对乌金丸有效成分阿魏酸和芍药苷的影响。通过统计学分析得出，以上不同60Co辐照量对乌金丸中阿魏酸及芍药苷含有量均无影响。本实验结果为进一步研究60Co辐照灭菌对乌金丸成分的影响提供一定的基础，也为其生产实践过程提供一定的参考依据。另外，对于乌金丸中其他成分的研究正在进行中，希望通过更多的成分指标考察60Co辐照对乌金丸质量的影响。

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InfIuence of60Co irradiation on active components in W ujin PiIIs by HPLC

LIYan-ping1， ZENG Xu-xin1， XIE Yan-ting1， TAN Zhen2， MO Jin-yu1， WU Jian-feng1*

（1.Medical Gollege，Foshan University，Foshan 528000，Ghina；2.Fengliaoxing Pharmaceutical Gompany，Foshan 528000，Ghina）

AIM To investigate the effect of60Co irradiation（0，2，6 and 10 KGy）on active constituents in Wujin Pills（Angelicae sinensis Radix，LeonuriHerba，GyperiRhizoma，Paeoniae Radix alba，etc.）by high-performance liquid chromatography（HPLC）.METHODS HPLC was employed to determine the contents of ferulic acid and paeoniflorin under different60Co irradiation doses.The obtained results were further analyzed by SPSS 18.0.RESULTS Exposed to 0，2，6 and 10 KGy60Co，the detected ferulic acid contents were 0.92，0.90，0.90 and 0.89 mg/g，respectively，and the paeoniflorin contentswere 1.76，1.83，1.78 and 1.78 mg/g，respectively.Through SPSS analysis，no statistical significance ofmeasured constituents was found between the data before and after irradiation（P＞0.05）.CONCLUSION There is no influence on the contents of active constituents in Wujin Pills with60Co irradiation.

Wujin Pills；ferulic acid；paeoniflorin；60Co irradiation sterilization；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）11-2430-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.020

2015-02-06

佛山社会组织发展专项扶持基本项目 （20140430）；佛山市医学类科技攻关项目 （2014AB00260）；广东省大学生创新创业训练计划项目 （201411847043）

李艳萍（1985—），女，博士，讲师。Tel：（0757）82836985，E-mail：lypfosu@126.com

*通信作者：吴剑峰 （1960—），女，博士，教授，从事天然活性成分的研究与开发。Tel：13612540388，E-mail：jianfeng839@ sina.com