雷米普利与曲美他嗪对慢性心力衰竭大鼠肾脏细胞凋亡及细胞色素C的影响

张梦云，杨晓欧，彭玉娟，冯翔宇，李秀华

基础与实验研究

雷米普利与曲美他嗪对慢性心力衰竭大鼠肾脏细胞凋亡及细胞色素C的影响

张梦云，杨晓欧，彭玉娟，冯翔宇，李秀华

目的： 探讨雷米普利与曲美他嗪单用及联合应用对慢性心力衰竭（CHF）大鼠肾脏细胞凋亡及细胞色素C（Cyt-C）表达的影响。

方法： 采用肾上腹主动脉缩窄术复制CHF模型，将50只雄性Wistar 大鼠随机分为假手术组、模型组、雷米普利组、曲美他嗪组和联合用药组（雷米普利+曲美他嗪），每组10只。利用TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡；逆转录聚合酶链反应法检测Cyt-C mRNA 含量以及Western Blot法检测肾脏细胞Cyt-C蛋白表达水平。

结果：与假手术组比较，模型组肾小管细胞凋亡指数（AI）、Cyt-C mRNA含量及蛋白表达量均显著增加（P＜0.01），与模型组比较，雷米普利组、曲美他嗪组和联合用药组的肾小管AI[（20.02±1.14）%、（20.10±1.20）%、（14.27±1.40）% vs（ 40.82±1.31）%]、Cyt-C mRNA表达量 （ 0.54±0.06、0.56±0.05、0.44±0.04 vs 0.89±0.03）及蛋白表达水平显著降低（1.50±0.11、1.58±0.12、0.75±0.06 vs 2.53±0.10），且以联合用药组降低最明显，差异均有统计学意义（P＜O.01）。

结论：雷米普利与曲美他嗪均可抑制肾脏细胞凋亡，有效改善肾脏功能，联合用药对细胞凋亡的抑制作用优于单一用药。

雷米普利；曲美他嗪；心力衰竭；细胞凋亡

Objective: To explore the effects of ramipril, trimetazidine and the combination of ramipril and trimetazidine on renal cell apoptosis index (AI) and cytochrome C (Cyt-C) expression in experimental rats with chronic heart failure (CHF).

Methods: CHF model was established by partially banding of abdominal aorta superior to renal artery in experimental rats. A total of 50 male Wistar rats were randomly divided into 5 groups: Sham operation group, Model group, Ramipril group, Trimetazidine group and Combination (ramipril and trimetazidine) group. n=10 in each group. Renal tubular cell AI was examined by TUNEL method, mRNA and protein expressions of Cyt-C were detected by RT-PCR and Western Blot analysis in each group respectively.

Results: Compared with Sham operation group, Model group had increased AI of renal tubular cells, increased mRNA and protein expressions of Cyt-C, P＜0.01. Compared with Model group, Ramipril group, Trimetazidine group and Combination group showed decreased AI of renal tubular cells (20.02 ± 1.14) %, (20.10 ± 1.2) % and (14.27 ± 1.40) % vs ( 40.82 ± 1.31) %; reduced Cyt-C mRNA expression (0.54 ± 0.06), ( 0.56 ± 0.05) and (0.44 ± 0.04) vs (0.89 ± 0.03); reduced Cyt-C protein expression (1.50 ± 0.11), (1.58 ± 0.12) and (0.75 ± 0.06) vs (2.53 ± 0.10); the most reduction was obtain by Combination group, all P＜0.01.

Conclusion: Ramipril and trimetazidine can inhibit renal cell apoptosis and effectively improve the renal function in CHFrats. Combined medication is better than either of them alone.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1208.)

近年来，随着慢性心力衰竭（CHF）发病率和死亡率的上升，肾功能不全发病率也逐年增高，并且肾功能损害是影响CHF患者病死率上升的独立因素。线粒体外膜通透性的改变在细胞凋亡中扮演着非常重要的角色，通透性的改变导致凋亡蛋白细胞色素C(Cyt-C)释放至胞浆，激活下游的caspase酶，引起细胞凋亡发生[1]。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI )类药物——雷米普利（RAM）最初仅用于治疗高血压，但临床研究发现有更多临床适应症：肾脏疾病、CHF和心血管疾病预防。曲美他嗪（TMZ）属于哌嗪类衍生物药物，是线粒体酶一长链3-酮酰辅酶A硫解酶(3-KAT)抑制剂，具有优化细胞能量代谢，减轻氧化应激，抑制活性氧自由基生成与释放，减少胞膜脂质氧化反应，在抑制细胞凋亡方面有一定作用[2]。

本实验通过观察CHF大鼠肾脏组织细胞凋亡情况及Cyt-C的表达，以探索两种药物在治疗CHF引起的肾脏损害疗效方面是否相似，以及联合用药的疗效是否更佳。

1　材料与方法

材料与试剂 :2014-01至2014-10选择50只清洁级雄性Wistar大鼠（北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号：2009-0004）。盐酸曲美他嗪（瑞阳制药有限公司）；雷米普利（昆山龙灯瑞迪制药有限公司）；TUNEL试剂盒[美国罗氏（Roche）公司]; Cyt-C引物（美国Invitrogen公司）；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；Trizol(美国Invitrogen公司)；Cyt-C兔抗多克隆抗体（武汉博士得公司）；组织裂解液（贝博科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Super ECL Plus 超敏发光液（美国Thermo公司）。

方法:（1）动物模型的建立、分组 ： 全部大鼠经1周适应性喂养后，随机抽取10只作为假手术组，假手术组大鼠只分离腹主动脉，不予结扎，其余大鼠均采用肾上腹主动脉缩窄术复制CHF模型[3]。将造模成功的Wistar大鼠随机分为模型组、雷米普利组、曲美他嗪组和联合用药组（雷米普利＋曲美他嗪），每组各10只。术后大鼠给予20万U青霉素连续3 d腹腔注射，并常规喂养4周，大鼠逐渐出现呼吸和心跳加快、反应迟钝、食欲减退等表现。经血流动力学参数检测：左心室舒张末压（IVEDP）≥15 mm Hg（1 mmHg＝0.133 kPa）标志CHF模型复制成功。雷米普利组给予雷米普利1 mg/（kg·d），曲美他嗪组给予曲美他嗪10 mg/（kg·d），联合用药组给予雷米普利1mg/（kg·d）＋曲美他嗪10 mg/（kg·d），均灌胃给药4周，假手术组及模型组给予等量生理盐水灌胃相同时间[4]。（2）细胞凋亡指数(AI)的检测：采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)检测肾脏细胞凋亡情况，石蜡组织切片脱蜡至水，采用PBS缓冲液(浓度为0.01 M，由90 g Nacl、29 g Na2HPO4·12 H2O和2.9 g NaH2PO4·2 H2O溶于1000 ml蒸馏水中，调PH值至7.2～7.4)洗5 min，加入胰蛋白酶去除组织蛋白，PBS缓冲液洗10 min，玻片干后滴加50 μl由50 μl脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）和450 μl荧光素标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）混合的反应液，阴性对照仅加50 μl荧光素标记的dUTP液，37℃反应1 h，采用荧光显微镜进行观察凋亡情况并计数，被激发出绿色荧光的细胞核为阳性细胞核，每个标本随机选取10个视野观察，分别对细胞总数和细胞凋亡核数进行计数并求其平均值，通过公式AI=凋亡细胞核数/总细胞核数×100%，计算肾脏AI。（3）RT-PCR检测Cyt-C mRNA表达：将新鲜肾脏组织从-80℃取出置于冰上解冻，按100 mg组织中加1 ml Trizol比例在匀浆器中进行研磨，离心，加氯仿、异丙醇和焦炭酸二乙酯（DEPC）水，使用紫外分光光度计法对提取的总RNA的纯度和浓度进行测量。Cyt-C的引物序列，上游引物：5’-CCTTTGTGGTGTTGACCAGC-3’；下游引物：5’-CCATGGAGGTTTGGTCCAGT-3’,扩增片段为140 bp，退火温度为50.5℃；β-肌动蛋白(β-actin)引物作为内参照，上游引物：5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；下游引物：5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA -3’，扩增片段为452 bp，退火温度为57℃。使用2%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳，使用Gel Plus统计软件进行定量分析，以各组Cyt-C吸光度（A）与其对应的内参照β-actin(A)的比值表示目的基因表达水平。（4）蛋白质免疫印迹（Western Blot）法检测Cyt-C蛋白:按照组织裂解液与蛋白定量试剂盒说明书准确提取各组大鼠肾脏总蛋白并测量蛋白浓度[5]，在95℃的水浴锅中将与Buffer按比例混匀的蛋白煮5 min变性，用20 μg质量上样，Cyt-C一抗浓度为1：200，二抗浓度为1：2000，β-actin的一抗浓度为1：1000，二抗浓度为1：2000，采用增强化学发光法(ECL)进行检测，显影。将胶片进行扫描处理，采用Gel Plus凝胶分析软件对显影条带进行分析，测定蛋白条带的吸光度值，以目的条带与内参照条带的吸光度的比值进行各组目的蛋白表达含量的比较。

2　结果

各组大鼠肾脏AI：图中绿色荧光的细胞核为凋亡细胞核，绿色荧光细胞核越多说明细胞凋亡的越多。假手术组几乎不存在凋亡细胞；与假手术组比较，模型组中凋亡的细胞数显著增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，雷米普利组、曲美他嗪组和联合用药组中凋亡细胞数量明显减少，联合用药组降低最显著，差异均有统计学意义（P＜0.01）；雷米普利组与曲美他嗪组比较，差异无统计学意义（图1，表1）。

图1　TUNEI法检测各组大鼠肾组织细胞凋亡的变化 (×200)

表1　各组大鼠肾脏AI、Cyt-C mRNA及Cyt-C蛋白表达的比较

表1　各组大鼠肾脏AI、Cyt-C mRNA及Cyt-C蛋白表达的比较

注：Cyt-C mRNA表达水平为各组大鼠Cyt-C mRNA与相应β-actin吸光度的比值；Cyt-C蛋白表达水平为各组大鼠Cyt-C蛋白与相应β-actin吸光度的比值；AI:细胞凋亡指数；Cyt-C：细胞色素C；β-actin：β-肌动蛋白。与假手术组相比*P＜0.01;与模型组相比△P＜0.01;与雷米普利组相比▲P＜0.01;与曲美他嗪组相比#P＜0.01

?

各组大鼠肾脏组织Cyt-C mRNA表达:与假手术组比较:模型组Cyt-C mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较：雷米普利组、曲美他嗪组和联合用药组Cyt-C mRNA表达均有所降低，以联合用药组下降最明显，差异有统计学意义（P＜0.01），雷米普利组与曲美他嗪组比较，差异无统计学意义（图2，表1）。

各组大鼠肾脏组织Cyt-C蛋白表达的比较：与假手术组比较：模型组Cyt-C蛋白平均吸光度值明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，雷米普利组、曲美他嗪组和联合用药组Cyt-C蛋白平均吸光度值均降低，其中以联合用药组降低最显著，差异有统计学意义（P＜0.01），雷米普利组与曲美他嗪组比较，差异无统计学意义（图3，表1）。

图2　RT-PCR法检测各组大鼠肾组织Cyt-C mRNA表达

图3　蛋白印迹检测各组大鼠肾组织Cyt-C蛋白的表达

3　讨论

心脏与肾脏拥有很多相似病理作用机制且二者关系十分密切，因此CHF常常伴有肾脏功能和结构的损害，并且还进一步加重心功能的恶化[6]。有研究表明肾脏在CHF早期可能存在肾小管细胞凋亡。CHF时由于肾脏灌注不足而处于缺血状态，能量代谢发生障碍，氧化应激反应增强、氧自由基生成增多和线粒体外膜受损是细胞凋亡的重要诱导因素[7]。

内源性线粒体凋亡途径在肾脏疾病中发挥十分重要作用，细胞的丢失是肾功能不全发生的一个重要病理生理基础[8]。线粒体在缺血缺氧、氧化应激、细胞钙超载等病理条件下，线粒体肿胀，外膜结构破坏，导致膜上的通透性转换孔(MPTP)开放，线粒体Cyt-C释放至胞浆[1,9]。Cyt-C定位于线粒体内膜上，为线粒体呼吸链的重要组成部分，线粒体膜间隙内缺乏Cyt-C会中断呼吸链的电子传递，ATP生成减少，能量缺失也可导致细胞凋亡。

国外有研究表明，氧化应激是肾脏疾病重要的病理生理机制，应用抗氧化剂对于肾脏疾病的治疗是有效的[10]。雷米普利属于ACEI类药物，通过有效抑制RAS系统中Ang II的生成，起到抗缺血抗氧化应激从而对肾脏具有保护作用[11]。因此有针对性地改善细胞能量代谢、抑制氧自由基产生、减少氧化应激反应可以改善肾脏缺血时细胞凋亡。曲美他嗪是一种新型独特的细胞保护剂，属于哌嗪类衍生物。曲美他嗪对缺血细胞的作用可能是直接的细胞保护作用，通过改善缺血细胞内的能量代谢，减少细胞内H+、Na+和Ca2+的超负荷，抑制氧自由基的生成，提高氧自由基的清除功能[12]。曲美他嗪可能具有抗细胞凋亡的作用[13]。1989年Aubert证实了曲美他嗪具有抗氧化特性。在缺氧状况下，线粒体内Ca2+超负荷可引起线粒体肿胀，氧化磷酸化障碍，曲美他嗪可与膜上的可通透性蛋白结合并使之失活以抑制Ca2+引起的线粒体肿胀，从而减少Cyt-C 释放，抑制caspase-3 活化，阻止细胞凋亡[4]。曲美他嗪曾多次被研究证明具有强大的抗氧化作用，可以抑制氧自由基的过度释放，减少细胞膜的脂质氧化[14]。

在本动物实验中显示，与假手术组相比，模型组的AI值明显升高，说明CHF大鼠的肾小管细胞存在明显的凋亡。药物干预后用药组AI值均有所下降，且联合用药组AI值下降最明显，说明雷米普利与曲美他嗪均可以抑制肾脏细胞凋亡，两者联合用药具有协同作用。RT-PCR与Western Blot 对Cyt-C检测的实验结果与AI的趋势保持一致，进一步说明CHF大鼠肾功能损害与细胞凋亡密切相关。

本实验结果说明了细胞凋亡是CHF大鼠肾功能不全的病理基础；雷米普利与曲美他嗪对肾功能的保护机制是减少氧化应激所诱导的细胞凋亡，改善肾脏功能，延缓肾功能衰竭，且联合用药疗效优于单一用药，且很可能与Cyt-C过表达和大量释放有关。为临床治疗CHF引起的肾功能损害提供了实验依据。联合用药对肾脏细胞凋亡的抑制作用最佳，其详细的作用机制，仍需进一步研究。

[1] Ueda N. Ceramide-induced apoptosis in renal tubular cells: a role of mitochondria and sphingosine-1-phoshate. Int J Mol Sci, 2015, 16: 5076-5124.

[2] 孙艳侠, 王国干, 崔小岱, 等. 曲美他嗪对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其机制. 中国循环杂志, 2012, 27: 224-227.

[3] Roussel É, Gaudreau M, Plante É, et al. Early responses of the left ventricle to pressure overload in Wistar rats. Life Sciences, 2008, 82: 265-272.

[4] 冯翔宇, 李彤, 李秀华, 等. 曲美他嗪与雷米普利对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的影响. 中华老年心脑血管病杂志, 2014, 16: 856-859.

[5] Huang T, Long M, Huo B. Competitive binding to cuprous Ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. Open Biomed Eng J, 2010, : 271-278.

[6] Iacoviello M. Evaluation of chronic kidney disease in chronic heart failure: From biomarkers to arterial renal resistances. World J Clin Cases, 2015, 3: 10.

[7] Li X, Wu G, Shang P, et al. Anti-nephrolithic potential of catechin in melamine-related urolithiasis via the inhibition of ROS, apoptosis, phosphor-p38 and osteopontin in male Sprague-Dawley rats. Free Redic Rec, 2015, 49: 1249-1258.

[8] Re RN. A possible mechanism for the progression of chronic renal disease and congestive heart failure. J Am Soc Hypertens, 2015, 9: 54-63.

[9] Azad MA, Akter J, Rogers KL, et al. Major pathways of polymyxininduced apoptosis in rat kidney proximal tubular cells. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59: 2136-2143.

[10] 胡越成, 张琦, 丛洪良. 曲美他嗪对心肾功能的保护作用. 中华老年心脑血管病杂志, 2013, 15: 98-101.

[11] Heerspink HJL, Gao P, Zeeuw DD, et al. The effect of ramipril and telmisartan on serum potassium and its association with cardiovascular and renal events: Results from the ONTARGET trial. Eur J Prev Cardiol, 2014, 21: 299-309.

[12] 张锐, 韦建瑞, 尹海燕, 等. 曲美他嗪对休克患者肾功能影响的临床研究. 中华危重病急救医学, 2014, 26: 219-222.

[13] Gong X, Fan G, Wang W, et al. Trimetazidine protects umbilical cord mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation induced apoptosis by activation of akt. Cell Physiol Biochem, 2014, 34: 2245-2255.

[14] Singh D, Chopra K. RETRACTED: Effect of trimetazidine on renal ischemia/reperfusion injury in rats. Pharmacological Research, 2004, 50: 623-629.

（编辑：汪碧蓉）

Effect of Ramipril and Trimetazidine on Renal Cell Apoptosis and Cytochrome C Expression in Experimental Rats With Chronic Heart Failure

ZHANG Meng-yun,YANG Xiao-ou, PENG Yu-juan, FENG Xiang-yu, LI Xiu-hua.
Department of Geriatrics, Affliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde (067000), Hebei, China
Corresponding Author: LI Xiu-hua, Email: lixiuhua76@126.com

Ramipril; Trimetazidine; Heart Failure; Apoptosis

河北省卫生计生委资助项目(20110180)

067000 河北省承德市，承德医学院附属医院 老年病科(张梦云、杨晓欧、李秀华)；山东省泰安市，第一人民医院 心内科(彭玉娟)；河北省，沧州市人民医院 心内科(冯翔宇)

张梦云 硕士研究生 主要从事慢性心力衰竭的病理生理研究 Email:15632495589@163.com 通讯作者：李秀华 Email:lixiuhua76@126.com

R541.6

A

1000-3614（2015）12-1208-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.12.018

（2015-03-25）