牛、羊乳及其乳制品中幽门螺杆菌污染及检测技术研究进展

张 于，江 涛，冉 健，文月玲，沈留红，余树民，曹随忠，姚学萍

（四川农业大学动物医学院，动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安 625014）

牛、羊乳及其乳制品中幽门螺杆菌污染及检测技术研究进展

张 于，江 涛，冉 健，文月玲，沈留红，余树民，曹随忠，姚学萍*

（四川农业大学动物医学院，动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安 625014）

近年来大量研究已经表明幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）可能是种食源性致病菌，而牛、羊乳是其最可能的感染源。食物中较难分离培养出Hp，而聚合酶链式反应相关技术灵敏度高，能检出样品中微量的Hp，可用于检测牛、羊乳中幽门螺杆菌的污染情况，但是与人类临床方面检测Hp技术的多样性、特异性与成熟性相比，食品中H p快速而有效的检测方法及相关标准还相对缺乏。本文主要就近年来牛、羊乳及其乳制品中 幽门螺杆菌污染及检测技术的研究进展进行综述，为进一步完善Hp传播途径与致病机制等研究提供一些参考。

幽门螺杆菌；牛乳；乳制品；检测技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）可使人引起多种胃肠道疾病，如慢性胃炎、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织（mucosal-associated lymphoid tissue，MALT）淋巴瘤及胃腺癌，同时也证实幽门螺杆菌与胃肠外疾病相关，如血液病、心脑血管病、肝胆疾病、皮肤病等[1]。幽门螺杆菌感染了世界范围内一半以上的人口，其发病率各个国家不同，甚至同一国家的各个地区也不相同。其发病率的高低与社会经济水平、人口密集程度、卫生状况和生活条件等相关。不同疾病是由H. pylori和宿主之间复杂的致病机制导致[2]。尽管感染的发病率很高，多种传播路径已经被提出（包括胃-口、口-口、粪-口途径），但是幽门螺杆菌感染人的宿主和传播途径仍不明确。根据其微生物学和流行病学特征，多个研究表明幽门螺杆菌可能是种食源性致病菌[3]。幽门螺杆菌在饮用水[4]、海水以及动物源性食品例如山羊[5]和牛[6]乳汁中已经被检测到。动物源性的首次污染或者不合理的处理方式（人类传染源）引起的二次污染都可能使得食品成为幽门螺杆菌感染的来源[7]。该感染主要发生于儿童期间，而牛、羊乳通常作为人类食物食用，尤其是小孩。一些研究已经表明，在乳制品和牛乳产品中有幽门螺杆菌的存在及生存[3,8]。因此Hp可能通过牛、羊乳及其乳制品从动物传播至人。Fujimura等[6]表明幽门螺杆菌在奶牛粪便和土壤中的检出率分别为50%和38%。此外，研究也表明在肉类、蔬菜和其他食品中幽门螺杆菌也能存活一段时间[9-10]。

1 幽门螺杆菌的生物学性状

1.1 培养特性

幽门螺杆菌为微需氧性革兰氏阴性菌，通常为螺旋状，有时可能呈现棒状，体外长期培养或抗生素治疗后可能呈现球菌状[11]。研究表明球菌样形式可能代表了一种活的非培养状态（viable but non-culturable state，VBNC），但是它们是否代表死细胞或一种有抵抗力的状态还不清楚[12]。球形变异的本质仍不清楚，其在Hp传播途径（尤其通过动物或食物）中的作用仍存在争议。幽门螺杆菌的酸适应使得细胞质pH值维持在中性水平，进而使菌体能生存于高酸性的胃酸中[13]。

1.2 分子生物学特征

幽门螺杆菌不同菌株间存在广泛的遗传变异性。Hp的全基因序列已经测出，其中尿素酶基因有4 个开放性阅读框，分别是UreA、UreB、UreC和UreD。UreA和UreB编码的多肽与尿素酶结构的两个亚单位结构相当[14]。幽门螺杆菌的尿素酶极为丰富，尿素酶催化尿素水解形成“氨云”保护细菌在高酸环境下生存[15]。此外，Hp的毒力取决于其产生空泡毒素（VacA）和细胞毒素相关蛋白（CagA）的能力。根据这两种基因蛋白存在与否，又将幽门螺杆菌菌株分成：Ⅰ型（CagA+和VacA+）和Ⅱ型（CagA－和VacA－），现多认为Ⅰ型菌株与胃疾病关系较为密切[16-17]。这些基因的分子特征不仅仅在Hp的诊断方面起着至关重要的作用，还有利于探索不同宿主种类或食品中分离或检测到的菌株间的基因关系。

2 流行病学特征

幽门螺杆菌定殖于世界半数人口的胃中，而该定植并不总是与病理学的发展相关，超过70%的受感染人群是无症状的[3]。但是一经感染，若不根除治疗，将终生携带。Hp感染主要发生于儿童期间，成人感染非常少。Hp感染的流行呈现显著的家庭内聚集现象，Hp阳性父母是其孩子感染的重要原因[16]。Hp的感染率在不同人群、不同人种、不同地区有很大差异，在发展中国家通常高于80%，在发达国家低于40%，感染率呈现全球持续下降的模式[11]。这可能与社会经济水平[18]，人口密集程度，卫生状况和生活条件等相关。至今幽门螺杆菌的传播途径还未彻底研究清楚，有证据支持通过胃-口，口-口以及粪-口传播，但是没有确切的数据证明通过这些途径传播的优势。人类感染Hp的最小剂量还未确定，105CFU可能接近最小感染量[19]。近年来大量研究证明食品污染在人类幽门螺杆菌感染中起重要作用，是幽门螺杆菌传播的途径之一，而牛、羊乳是其中最可能的感染来源[5,20]。

3 牛、羊乳及其乳制品中幽门螺杆菌的污染

幽门螺杆菌在牧民中的感染率极高。通过13C-urea呼吸测试对42 名牧民及其28 名家庭成员幽门螺杆菌的检测研究发现，Hp在牧民中感染率达97.6%，家庭成员感染率为86%，而没有与羊接触的对照中感染率相对较低，为65.1%[21]。与此同时，与羊接触的牧民孩子的幽门螺杆菌感染率是城市孩子的两倍[22]。由此推测牧民孩子的幽门螺杆菌感染可能是来自羊[3]。这些研究使得幽门螺杆菌感染被认为是人畜共患病。

研究表明绵羊原乳和胃组织中均已发现幽门螺杆菌DNA，此外，恒河猴、狒狒、猫等动物胃内Hp检测阳性，说明它们可能是Hp的自然宿主，是但其确切的传播方式还需进一步研究[23-24]。Ghasemian等[8]研究发现，92 份奶牛血清样品中，25 份（27%）为Hp IgG抗体阳性，67 份为阴性；对于血清学反应为阳性的奶牛，10 份粪便（40%）、4 份乳汁（16%）为Hp抗原阳性，4 份既是乳汁Hp抗原阳性，也是粪便Hp抗原阳性。由此推测，奶牛血清中幽门螺杆菌抗体的存在可能暗示着幽门螺杆菌在奶牛体内共生，其可能是幽门螺杆菌的自然宿主。

表1 牛奶样品中幽门螺杆菌污染情况Table 1 Detection ofHelicobacter pylori ori contamination in milk

Dore等[23]采用16S rRNA检测63 份绵羊原乳，38 份原乳检出幽门螺杆菌DNA，而再用Hp vacA基因检测38 份原乳发现5 份阳性，序列分析显示与Hp特异性DNA序列同源性达99%，这可能因为16S rRNA针对幽门螺杆菌属特异性，Hp可能存在不同的分子分型。从原乳样品中分离出幽门螺杆菌是极其罕见的[6]，Turutoglu等[25]从440 份山羊原乳样品中都未分离培养出任何幽门螺杆菌。牛奶是一种保质期短的食品，幽门螺杆菌能短期存活于牛乳中[26]。祝雯雯等[9]研究人工模拟不同环境介质中幽门螺杆菌的生存状况发现，Hp在牛乳中的存活时间最长，且存活时间与环境介质温度成负相关。为此，被人类或动物污染的牛乳可能确实是幽门螺杆菌传播的重要来源。近年来报道的关于牛、羊乳及其乳制品中幽门螺杆菌的污染情况如表1所示。

4 牛奶中幽门螺杆菌的检测

4.1 细菌培养法

Hp分离培养是诊断Hp感染最经典、最可靠的方法之一，可作为验证其他诊断性实验的金标准。Hp的培养基一般分为固体培养基和液体培养基两种。邝玉等[28]采用添加有10%脱纤维兔血和混合抗生素的哥伦比亚琼脂培养基，置于厌氧罐37 ℃培养72 h 能生长出典型的幽门螺杆菌。由于血液容易污染，费用较高，且易造成溶血，影响培养效果，所以已有研究用卵黄替代血制备培养液[29]。液体培养成功的关键在于气体能否在培养基中弥散。梁昌盛等[30]证实采用抽气换气法可以有效保证培养所需的气体环境。Joo等[31]发现了一种切实可行的多功能液体培养技术—薄层液体培养技术，用于研究Hp的细菌特性。从食品中分离幽门螺杆菌极其困难，而且Hp对体外生长条件要求严苛、培养困难，培养时往往变异为非可培养的球形[12]，因此传统培养方式用于快速而准确的检测与鉴定有一定局限性。

4.2 PCR检测

近年来聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术已经用于Hp的诊断，该技术的敏感性比寡核苷酸探针增加了100 倍，可以检出少至100 个Hp[32]，并且不必要求活菌。目前Hp的尿素酶基因和16S rRNA基因的部分序列已经测出，为PCR特异性引物的选择提供了依据。

4.2.1 直接PCR

目前幽门螺杆菌的多 种基因，如尿素酶（A、B、C、D）基因、16S rRNA基因、VacA及CagA基因均已克隆成功，根据幽门螺杆菌不同的靶基因，设计不同的引物，从而建立不同的PCR系统，用以检测Hp都取得了成功。Hoshina等[33]首次应用PCR技术扩增16S rRNA基因检测Hp。Dore等[5]应用16S rRNA基因的特异引物进行PCR检测发现60%绵羊原乳存在幽门螺杆菌；此后，Ebrahim等[34]应用ureC基因特异引物进行PCR，不仅在奶牛、山羊和绵羊原乳中检测到幽门螺杆菌，而且首次在骆驼和水牛原乳中发现Hp DNA。史艳宇等[35]以尿素酶基因序列为靶位点设计引物，建立的幽门螺杆菌PCR检测方法敏感度为8 CFU/mL。

4.2.2 逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）

采用PCR最主要的缺 陷在于其不能区分可培养的或者死的细菌，从而提出通过RT-PCR来解决此问题。RNA作为生物活性的标志，RT-PCR最大的优点就在于利用RNA反转录出cDNA作为扩增的目标片段，从而解决死菌DNA带来的假阳性问题[36]。张少华等[37]取患者胃黏膜组织用qRT-PCR检测幽门螺杆菌Hp 16S rRNA基因阳性率为67.9%，与之前江南等[38]报道结果一致。

4.2.3 巢式PCR（nested-PCR）

巢式PCR用两套引物，第一套用于产生扩增的DNA片段，此片段中含有第二轮PCR引物的结合位点，第一轮反应产物被等分转入第二轮PCR引物，扩增靶DNA，连续两次放大，具有更好的灵敏性和特异性[39]。Fujimura等[6]设计两对上游引物（A-2F2和A-2F3），一对下游引物（A-2R），A-2F2、A-2R用于首次扩增，A-2F3、A-2R作为内引物，通过半巢式PCR（semi-nested PCR）扩增ureA基因，发现奶牛原乳和巴氏消毒牛奶中各有72.2%和55%存在Hp DNA；Quaglia等[26]通过巢式PCR检测人工污染的绵羊、山羊和奶牛原乳glmM基因，得出幽门螺杆菌的检测敏感性可达到3 CFU/mL。

4.2.4 其他方法

Quaglia等[40]使用多重PCR（multiplex PCR，MT-PCR）检测绵羊原乳中幽门螺杆菌，得出其检测敏感度为15 CFU/mL。刘静秋等[41]根据Hp尿素酶基因设计特异性引物及探针，成功建立了食品中幽门螺杆菌的荧光PCR检测方法，特异性强，检测敏感度可达到3 CFU/mL。Sehee等[42]研究使用叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）结合实时PCR（realtim e PCR）能有效区分出幽门螺杆菌的可培养形式及死菌形式。PCR及RT-PCR技术要求高，且具有高度敏感性，临床标本易污染，因此应该严格设置阳性和阴性对照从而保证检测结果的可靠性。除此之外，水或食品中幽门螺杆菌的检测方法还包括微生物学法、免疫磁分离技术结合PCR、放射自显影技术以及ATP生物荧光检测等[23]，但是都存在一定缺陷：微生物学法虽具高选择性但是敏感性较低；免疫磁分离技术结合PCR虽然可以聚集食品中的微生物，但是费用高、要求严格且耗时；后两者虽已成功应用于水源、人类粪便中Hp的检测，但是还未 用于食品中，并且ATP不能区别食品中不同细胞来源。为此相对于人类临床方面Hp的检测技术，至今国内尚无食品中幽门螺杆菌快速、简便而有效的检测方法及相关标准。

5 结 语

幽门螺杆菌已被确定与多种胃肠道疾病相关。研究已经证明食品为幽门螺杆菌的生存提供了环境，食物和水可能在幽门螺杆菌传播过程中起着媒介作用，而牛、羊乳是其中最可能的感染来源。直接与奶牛粪便接触或间接与土壤接触是牛、羊乳污染的主要来源，牛、羊乳可以在生产过程中被污染或者产品后期卫生管理不充分，这些都可能传播幽门螺杆菌至人类。但是幽门螺杆菌很难从食品中分离出来，尤其是还未从牛、羊乳以外的其他食品中分离出Hp，一方面可能由于幽门螺杆菌分离的方法缺乏足够的敏感性从而获得较少数量的幽门螺杆菌；另外，球菌样形式在幽门螺杆菌传播途径中的作用一直存在争议。故而至今还缺乏有利的数据证明食品污染在幽门螺杆菌传播中的具体作用。研究显示Hp可随粪便排出，那么Hp感染究竟源于动物源性的首次污染还是处理不恰当引起的二次污染也需进一步研究，为此，未来应该进行更多关于动物性食品中幽门螺杆菌的存在与生存研究，检测屠宰消费动物肉食品的Hp并与病人的Hp基因关系进行分析。探讨动物性食品中幽门螺杆菌污染情况不仅 有利于保障食品安全，更为进一步完善幽门螺杆菌传播途径与致病机制等的研究提供参考，同时在有效预防幽门螺杆菌感染方面也有着重要意义。

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Recent Progress in Contamination and Detection Techniques of Helicobacter pylori in Milk and Dairy Products

ZHANG Yu, JIANG Tao, RAN Jian, WEN Yueling, SHEN Liuhong, YU Shumin, CAO Suizhong, YAO Xueping*
(Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In recent years, a larg e number of studies have shown that Helicobacter pylori may be a food-borne pathogen, and milk is one of the most likely sources of its infection. Isolation and culture of H. pylori from food samples is exacting and time-consuming. At present, PCR and related technologies, which have high s ensitivity, are applied to detect trace amounts of H. pylori in food samples such as milk. However, there is lack of rapid and effective detection methods an d related standards for H. pylori in food samples although a variety of specifi c and mature assays are currently available for clinical use. This review focuses on recent progress in contamination and detection techniques of H. pylori in milk and dairy produ cts, so as to provide some referen ces for further research on transmission and pathogenic mechanisms of H. pylori.

Helicobacter pylori; cow’s milk; dairy products; detection techniques

Q93.332

A

1002-6630（2015）01-0268-05

10.7506/spkx1002-6630-201501051

2014-01-19

四川省科技厅科技支撑计划项目（2011NZ0060；2013NZ0032）；教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目（IRT0848）

张于（1991—），女，硕士研究生，研究方向为动物性食品卫生学。E-mail：zhangyu6304@163.com

*通信作者：姚学萍（1974—），女，高级实验师，硕士，研究方向为动物性食品卫生学。E-mail：170802926@qq.com