Ras-GRF1基因敲除小鼠的行为学研究

段巍鹤，郑宏亮，陆美林，万家余，何秀霞

（1.长春理工大学 校医院，长春 130022，2.长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022，3.军事医学科学院 军事兽医研究所，长春 130122）

细胞内信号传递通过中心转换站接收、调节和传递信号。小分子量G蛋白家族构成了对生长、分化、形态发生、囊泡转运和细胞骨架形成极其重要的膜相关转运站。Ras蛋白是一个分子质量为21kD左右的单体GTP酶，参与典型的G蛋白激活和失活循环。Ras突变常见于人类许多癌症中。突变后持续活化的生长信号导致细胞的恶性增殖。并且，Ras蛋白大量存在于神经中枢中。因此，Ras蛋白在细胞的生长分化、细胞的癌变、信号的的传递等方面扮演着重要的作用，其在癌症的预防、诊断、治疗方面的研究越来越深入，而在学习记忆功能方面的研究同样受到了国内外的关注［1，2］。为此，对Ras基因和蛋白的细致研究可以产生巨大经济价值和医疗价值，将会对人类肿瘤的治疗和学习记忆功能的发展带来突破性的进展［3-7］。

本实验利用敲除Ras-GRF1基因的雌性小鼠（Ras-GRF10/0）进行自主活动实验以检测机体运动状态；通过莫里斯水迷宫实验评估转基因和敲除小鼠学习与记忆能力［8-12］；通过避暗穿梭实验、跳台实验等判断小鼠学习和记忆功能是否受到影响［13］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验小鼠

Ras-GRF10/0基因敲除小鼠由美国公司构建，野生型老鼠由军事医学科学院兽医研究所提供。各品系老鼠均有十四只。

1.1.2 实验仪器

伯乐高电压电泳仪Biorad Powerpac HV 164-5056，伯乐小型电泳槽，伯乐C1000 PCR仪均为伯乐公司生产；Morris水迷宫视频分析系统，避暗穿梭测试仪XR-YLS-17B，自主活动箱，跳台实验设备均为北京众实迪创科技发展有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 Ras-GRF10/0纯合敲除鼠的扩繁

将成年（大于6周龄）首建的杂合敲除鼠按每笼3只雌鼠1只雄鼠合笼，养殖房需要温度可控（22℃），采取等昼夜长，水和食物可以供小鼠自由食用的方式来饲养。待母鼠产的子代小鼠长到5周大的时候，打耳号区分每一只鼠。

1.2.2 Ras-GRF10/0基因敲除小鼠的鉴定

利用Axygen公司提供的AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取小鼠的基因组。将提取DNA进行PCR以鉴定所用Ras-GRF10/0老鼠是否为纯合老鼠。

1.2.3 自主活动箱

自主活动箱由长方体不透光的封闭空间组成。内壁含有4个光电管，可以测定小鼠的自主活动次数。将小鼠轻轻放进自主活动箱，然后将盖子盖上。以5min为测试时间，连续五天。第一次实验时需给予小鼠3min适应实验。

1.2.4 Morris水迷宫

连续进行7天定位航行试验；第八天撤去隐藏平台，即空间搜索实验。将小鼠轻轻地放置在隐藏的平台，小鼠在随后会逃离平台，允许小鼠在池内游泳，以适应环境，然后用手，引导小鼠慢慢游向隐藏平台，并保证小鼠在平台上至少停留15s。在水迷宫分析系统中人为地将水池分为4个象限，分后随机在4个象限中选取入水点。入水时，小鼠面向水池壁，防止其观察到隐藏平台，然后让小鼠在四个象限中自由游泳，时间规定为120s。若在120s内小鼠找到隐藏平台并在平台停留至少5s，则结束实验，时间即为该小鼠的逃避潜伏期；若没有找到，则需要人为地诱导小鼠寻找隐藏平台，然后让其停留至少15s，逃避潜伏期记作120s。同时记录每次小鼠的游泳轨迹。第八天进行空间搜索实验，在没有隐藏平台的情况下，记录小鼠第一次穿越平台的时间，游泳轨迹以及在120s内穿越平台的次数。

1.2.5 避暗穿梭

实验设备是由长宽各为20cm，高为15cm的四个不透光的封闭空间组成，分为A、B、C、D四个区域，A和C作为一组测量仪器，B与D作为一组。其底部均由可通电的电栅组成。每个空间内有均有自动传感器可以测量小数的活动。实验时，将小鼠轻轻的放进A、B两室中，然后将盖子盖上，通电后，A、B两室将闪烁灯光，C、D两室会以限压30V，限流0.5mA的电流持续通电。以5min为测试时间，连续三天。同样第一次实验时需给小鼠3min的适应时间。

1.2.6 跳台实验

将小鼠放置到实验设备的圆柱体平台中，将盖子盖上。将会有限压30V，限流0.5mA的电流通过底部的电栅。以5分钟为测试时间，连续两天。在第一天的实验中，给予小鼠三分钟的适应时间。

每批小鼠在完成上述实验后，都要及时的用清水清理实验仪器，防止有气味等因素干扰小鼠的判断。实验前后保持安静，温度为21℃恒定。

2 实验结果

2.1 Ras-GRF10/0纯合老鼠的鉴定

为了得到足够数量的纯合Ras-GRF10/0小鼠，进行种内自交，在F1代群体中，通过PCR技术鉴定杂合型和纯合型后代。通过图1PCR的鉴定结果可以看出，杂合型小鼠电泳结果中有两条电泳条带如5、7、8、9、10、11、12泳道，有清晰单一条带的为Ras-GRF10/0纯合小鼠如3、4泳道，2、6泳道则为野生型小鼠。以PCR检测为纯合的小鼠进行后续实验。

图1 Ras-GRF10/0PCR鉴定结果

图1中，1为DL2000 Marker；2和6：野生型小鼠PCR结果；3和4：Ras-GRF10/0纯合小鼠的PCR结果；5，7，8，9，10，11，12：为Ras-GRF10/0杂合小鼠的鉴定结果.

2.2 自主活动实验结果

在自主活动的实验中，野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠在活动性上随着时间的推移均有所下降，但下降的幅度不大，且Ras-GRF10/0小鼠活动次数整体少于野生型小鼠。但是没有显著性差异。实验数据见表1。

表1 野生型小鼠和Ras-GRF10/0型小鼠自主活动次数（单位：次）

表2 野生型小鼠与Ras-GRF10/0型小鼠逃避潜伏期（单位：秒）

2.3 水迷宫实验结果

2.3.1 定位航行试验结果

由Morris水迷宫得出两种小鼠的平均逃避潜伏期见表2，野生型小鼠逃避潜伏期有逐渐降低的趋势，实验的5～7天逃避潜伏期有平稳的趋势。而Ras-GRF10/0小鼠的逃避潜伏期在实验的前两天几乎没有变化，从实验的第三天开始，有逐渐降低的趋势。对比野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠，可以明确发现两者在逃避潜伏期的第1天没有显著差异，第2天则表现差异显著（P＜0.05），第3～7天则差异极显著（P＜0.01）。从游泳轨迹（见图2）也证实了这一点，即随着时间的延长，野生鼠目的性更强，游泳轨迹更直接。

2.3.2 空间探索实验

实验的第八天，撤去水下的隐藏平台。通过对比野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠在120s内穿越平台的平均次数，可以发现野生型平均穿越次数为6.1要大于Ras-GRF1基因敲除小鼠的5次穿越次数。虽然在统计学上没有显著差异，但从两者空间探索轨迹可以看出野生鼠的探索次数多于Ras-GRF10/0小鼠，搜索性更强（图3）。

2.4 避暗穿梭实验结果

从表3避暗实验结果显示，5min内两种小鼠被电击次数在第一天有显著差异，之后则没有表现出差异，但Ras-GRF10/0型小鼠被电击次数多于野生型小鼠。对比野生型小鼠和Ras-GRF10/0型小鼠主动回避潜伏时间可以看出（如表4）在实验的第一天潜伏期都很短，但Ras-GRF10/0型小鼠第一天和第二天的潜伏期均远远低于野生型小鼠，在实验的第三天，即最后一天中，这两种小鼠的差异变得很小。

2.5 跳台实验结果

图2 野生型小鼠与Ras-GRF10/0型小鼠游泳轨迹

图3 野生型小鼠和Ras-GRF1小鼠空间探索轨迹

通过分析对比跳台实验结果（图4）可以看出两者在跳下平台的时间没有显著差异，但Ras-GRF10/0型小鼠的潜伏期小于野生型小鼠。在第一天的实验中，Ras-GRF10/0型小鼠跳台次数大于野生型小鼠差异显著。在第二天的实验中两种小鼠的跳台次数略有差距（见图5）。

表3 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠5min被电击次数（单位：次）

表4 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠主动回避潜伏时间（单位：秒）

图4 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠第一次跳下平台的时间

图5 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠5min内跳台次数

3 讨论

自主活动实验结果说明，在自主活动能力上、在体力上，野生型小鼠与Ras-GRF10/0型小鼠没有较大的区别。跳台试验说明Ras-GRF10/0型小鼠的平均潜伏期与野生型大致相同，但跳台次数Ras-GRF10/0型小鼠多于野生型。Morris水迷宫的空间探索实验结果说明Ras-GRF10/0型小鼠对平台所在位置并没有显著的记忆。避暗穿梭实验进一步说明Ras-GRF10/0型小鼠的学习记忆能力不如野生型小鼠。

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