喘息患儿气道炎症细胞检测的临床意义

邓莉莉，何骁，雷晔飞，李康杰，肖启亮

（1.湖南省郴州市第一人民医院北院（儿童医院）儿科，湖南 郴州 423000；2.湖南省郴州市第一人民医院中心医院骨科，湖南 郴州 423000；3.南华大学附属第二医院儿科，湖南 衡阳 421001）

喘息患儿气道炎症细胞检测的临床意义

邓莉莉1，何骁2，雷晔飞1，李康杰2，肖启亮3

（1.湖南省郴州市第一人民医院北院（儿童医院）儿科，湖南 郴州 423000；2.湖南省郴州市第一人民医院中心医院骨科，湖南 郴州 423000；3.南华大学附属第二医院儿科，湖南 衡阳 421001）

目的观察喘息患儿痰液炎症细胞的比例及变化，并探讨其意义。方法支气管哮喘患儿30例（哮喘组），喘息性支气管炎患儿90例（按喘息发作次数分为喘息Ⅰ组30例和喘息Ⅱ组60例，后者按喘息从首次至末次发作的时间长短分为喘息Ⅱa组及喘息Ⅱb组各30例），同期健康体检儿童30例（对照组），采用诱导痰技术检测痰液嗜酸性粒细胞（Eos）、中性粒细胞（Neu）、淋巴细胞（Lym）比例。结果Eos比例：在喘息发作时，喘息各组明显高于喘息停止后的喘息各组及对照组（P＜0.01），喘息Ⅰ组明显低于喘息Ⅱ组（P＜0.01），喘息Ⅱa组低于喘息Ⅱb组（P＜0.01），而喘息Ⅱb组与哮喘组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；在喘息停止后，喘息Ⅰ组Eos比例迅速下降，与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而喘息Ⅱb组Eos比例仍较高，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），与哮喘组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Neu比例：在喘息发作时，喘息各组明显高于喘息停止后的喘息各组及对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；在喘息停止后，喘息Ⅰ组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），喘息Ⅱ组其Neu比例仍较高，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），与哮喘组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而喘息Ⅱa组与喘息Ⅱb组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Lym比例：在喘息发作时，喘息各组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；在喘息停止后，喘息各组均较喘息发作时喘息各组和对照组高，差异有统计学意义（P＜0.01），喘息Ⅱ组比例高于喘息Ⅰ组（P＜0.01），与哮喘组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论结合临床病史，动态观察痰液炎症细胞的比例及变化，可能会对喘息性支气管炎发展成哮喘的早期诊治有一定价值。

支气管哮喘；喘息性支气管炎；诱导痰；炎症细胞

诱导痰技术在呼吸系统疾病气道炎症的基础研究和临床应用中的作用受到越来越多的重视。随机选择支气管哮喘患儿30例和喘息性支气管炎患儿90例，于喘息发作时、喘息停止后利用诱导痰技术检测痰液炎症细胞的比例及变化，旨在探讨喘息性支气管炎发展为哮喘的可能机制，为哮喘病早期诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1临床资料

随机选择2012年11月-2013年11月郴州市第一人民医院北院收治的符合喘息性支气管炎诊断标准[1]的喘息性支气管炎患儿90例。按喘息发作次数分为喘息Ⅰ组（喘息仅发作1次者）30例，其中男15例，女15例，年龄13个月～3岁；喘息Ⅱ组（喘息发作3次或3次以上者）60例。后者按喘息从首次至末次发作的时间长短分为喘息Ⅱa组（喘息发作时间＜1年者）30例，其中男14例，女16例，年龄14个月～3岁；喘息Ⅱb组（喘息发作时间≥1年者）30例，其中男16例，女14例，年龄15个月～3岁。另选轻度支气管哮喘患儿30例（哮喘组），其中男16例，女14例，年龄2～4岁，均符合儿童支气管哮喘诊断标准[2]。对照组30例系同期健康体检儿童，男14例，女16例；年龄2～3岁。以上3组在性别、年龄比较上差异无显统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1痰液诱导参照欧洲呼吸协会诱导痰液指导小组的指南[3]并加以改进。对照组、观察组急性期（入院24 h内）及临床缓解期（临床症状停止及哮鸣音消失后5 d）进行诱导痰，具体方法如下：受试者清洁口鼻后吸入200μg沙丁胺醇，用医用面罩式超声雾化器，直接吸入3%高渗盐水，流量为1 L/min，诱导20～30 min，诱导过程中随时将痰咳出，不易咳出者则由专职护师按正规操作吸痰，将痰置于干净、无菌的带刻度容器中。同时严密观察小儿的呼吸频率、气喘等情况，如不能耐受或吸入高渗盐水后30 min仍无痰液导出则立即停止操作。收集的痰液在1 h内处理，处理前置入4℃冰箱保存。

1.2.2痰液处理①选取合格痰液。挑取含黏液的痰栓，显微镜下观察鳞状上皮细胞小于5%并可见肺巨噬细胞时认为是合格[4]。②将痰液称重，加入4倍痰量0.1%的二硫苏糖醇，在旋涡式混合器上混匀。③置于37℃恒温水育箱孵育15 min。④加4倍痰量磷酸盐缓冲液（PBS）后继续水浴5 min。⑤将稀化的痰液经48μm尼龙膜过滤后，离心机2000r/min离心

10 min，收集上清液，置入-70℃冰箱冷冻保存待测；细胞成分重悬于PBS中，涂片2张，编号。

1.2.3痰液染色（HE染色）将涂片自然干燥后置于二甲苯内2 min。再移至无水酒精内2 min，取出排液后移至90%酒精内1 min。再移至苏木素染液内静置30 min，然后置入冲洗盆内冲洗10 min，使粉红色变为蓝色。涂片在盐酸酒精内浸渍伴摇动数秒，再次冲洗使涂片再次变蓝。将涂片移到1%伊红液内2 min，对比染色，再冲洗涂片3 min，分化伊红。取出排液后移到90%酒精内摇振15 s，再移至无水酒精Ⅰ内摇振15 s，再移至无水酒精Ⅱ内摇振30 s。涂片移至二甲苯Ⅰ内15 s，再移至二甲苯Ⅱ内15 s，取出后封固。

1.2.4痰液分类计数由不知道患者病情的病理医师在高倍显微镜下计数400个有核细胞包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞，并计算各自百分比率，分别用Eos%、Neu%、Lym%、Mar%表示。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较前均进行正态检验和方差齐性检验，两样本均数比较依据方差齐性结果用t检验或t'检验，多个样本均数比较用方差分析，组间两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

痰液炎症细胞分类计数测定结果（见表1、2）。

表1 喘息发作时各组炎症细胞百分数比较（%，±s）

表1 喘息发作时各组炎症细胞百分数比较（%，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.01；2）与对照组比较，P＞0.05；3）与哮喘组比较，P＞0.05

组别nEosNeuLymMar喘息Ⅰ组306.33±0.431）60.54±0.311）1.39±0.102）31.74±0.05喘息Ⅱa组309.38±0.411）60.58±0.341）1.38±0.102）28.66±0.02喘息Ⅱb组3015.45±0.281）3）60.62±0.391）1.40±0.112）22.53±0.01哮喘组3015.56±0.321）60.64±0.411）1.42±0.102）22.38±0.05对照组300.48±0.0438.34±0.251.44±0.0959.74±0.02

表2 喘息停止后各组炎症细胞百分数比较（%±s）

表2 喘息停止后各组炎症细胞百分数比较（%±s）

注：1）与对照组比较，P＞0.05；2）与对照组比较，P＞0.05；3）与哮喘组比较，P＜0.01

组别nEosNeuLymMar喘息Ⅰ组300.47±0.041）38.31±0.151）10.42±0.063）50.80±0.04喘息Ⅱa组306.24±0.0650.40±0.072）15.39±0.093）27.97±0.03喘息Ⅱb组哮喘组30 30 10.49±0.052）10.50±0.25 50.40±0.182）50.41±0.27 15.41±0.073）15.42±0.103）23.70±0.04 23.67±0.05对照组300.48±0.0438.34±0.251.44±0.0959.74±0.02 P值0.0010.0030.0020.004

2.1Eos比例

在喘息发作时，喘息各组明显高于喘息停止后的喘息各组及对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），喘息Ⅰ组明显低于喘息Ⅱ组，差异有统计学意义（t=-12.45，P＜0.01），喘息Ⅱa组低于喘息Ⅱb组，差异有统计学意义（t=-77.23，P＜0.01），喘息Ⅱb组与支气管哮喘组比较，差异无统计学意义（t= -1.61，P＞0.05）；在喘息停止后，喘息Ⅰ组Eos比例迅速下降，与对照组比较，差异无统计学意义（t= -1.13，P＞0.05）,而喘息Ⅱb组Eos比例仍较高，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），与支气管哮喘组比较，差异无统计学意义（t=-0.54，P＞0.05）。

2.2Neu比例

在喘息发作时，喘息各组明显高于喘息停止期后的喘息各组及对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；在喘息停止后，喘息Ⅰ组与对照组比较，差异无统计学意义（t=-0.55，P＞0.05），喘息Ⅱ组Neu比例仍较高，其与对照组比较，差异有统计学意义

（P＜0.01），与支气管哮喘组比较，差异无统计学意义（t=-1.12，P＞0.05），而喘息Ⅱa组与喘息Ⅱb组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3Lym比例

在喘息发作时，喘息各组与对照组比较差异无统计学意义（F=1.85，P＞0.05）；在喘息停止后，喘息各组均较喘息发作时的喘息各组和对照组高，差异有统计学意义（P＜0.01），喘息Ⅱ组Lym比例高于喘息Ⅰ组（P＜0.01），与支气管哮喘组比较，差异无统计学意义（t=-1.09，P＞0.05）。

3 讨论

诱导痰是以高渗盐水雾化吸入诱导无痰或少痰受检者产生足量痰液，以对下气道分泌物中的细胞及其他液相成分进行分析研究的一种无创的检测方法。作为一种直接的非侵入性定量定性检测气道炎症的方法[5]，诱导痰安全、可靠[6-7]、简便且患者易于接受，其具体优点表现如下：①标本来源丰富，易浓缩和重复，且安全性高；②可提供与支气管肺泡灌洗液相似的气道炎症的定量信息；③可直接检出与炎症反应相关的炎症细胞、炎症介质和细胞因子；④诱导痰液来源于外周气道至中央气道比来源于肺段气道和肺泡的分泌物，更能反映气道分泌物的自然状态。本实验采用雾化吸入3%高渗盐水后诱导痰，在严格的观察下研究对象都能耐受检查且痰处理、细胞分类计数均操作顺利，结果较满意，无一例出现气促、发绀等病情加重而出现实验中断，这表明诱导痰确实为一种研究气道炎症的较理想的方法。因痰液细胞成分可进行细胞分类、免疫组织化学和分子生物学等检查；液相成分可用于分子成分的测定[8]，因此可利用反复喘息患儿的痰液，通过其细胞成分来研究气道炎症发生的可能机制。

GERENG等[9]发现，哮喘患者诱导痰中嗜酸粒细胞的形态和功能与血液检测结果一致，嗜酸粒细胞是临床反映气道炎症的重要标志。本研究结果显示，在喘息发作时，喘息各组Eos比例明显高于喘息停止后的喘息各组及对照组（P＜0.01），说明嗜酸粒细胞参与喘息性支气管炎和哮喘的发病，与LOUIS等[10]的研究结果一致；喘息Ⅰ组明显低于喘息Ⅱ组和支气管哮喘组（P＜0.01），喘息Ⅱa组低于喘息Ⅱb组（P＜0.01），而喘息Ⅱb组与支气管哮喘组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），可见Eos比例具有随病情进展和喘息发作次数的增加而增加的趋势，发作频率越高，这一趋势越明显，这可能是由于支气管哮喘是一种特殊类型的慢性气道炎症性疾病，他有一个发生、发展的过程，在未给予抗哮喘（或抗嗜酸性粒细胞性气道炎症）治疗前或未进行正规系统的治疗，其呼吸道可能会表现出持续存在并缓慢进展的炎症改变，从而导致痰液嗜酸粒细胞不断随病情进展和发作次数的增加而逐渐增加。在喘息停止后，喘息Ⅰ组Eos比例迅速下降，与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而喘息Ⅱb组Eos比例仍较高，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），与支气管哮喘组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示喘息停止后气道炎症和气道高反应仍可以长期存在。因此，本研究为哮喘病长期规范治疗的必要性提供一定的理论基础，即哮喘病诊断一旦成立，不论轻重，都应该进行及时持续地抗炎治疗。同时，本研究也提示，未明确诊断哮喘者，若喘息发作次数较多，尤其是发作持续时间较长者，也应坚持抗炎治疗。

嗜酸性粒细胞浸润性炎症作为哮喘的基本特征已为人们所接受。从最新的GINA方案对哮喘的定义可以看出，人们对哮喘发病机制与病理生理的认识不再局限在嗜酸性细胞浸润为主要特征的气道炎症性疾病，而是强调多种细胞参与的气道慢性炎症。随着诱导痰技术的发展及其进一步在临床的推广应用，发现哮喘可能存在以其他炎症细胞为主的呼吸道炎症[11-14]。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）可使T淋巴细胞浸润到气管，而淋巴细胞被认为在形成呼吸道高反应性的过程中起了重要作用。本研究结果显示，在喘息停止后，喘息各组Lym比例较喘息发作时喘息各组和对照组高（P＜0.01），与SHIOTA等[15]的文献报道一致，尤其喘息Ⅱ组Lym比例较高，与支气管哮喘组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示淋巴细胞可能在维持哮喘慢性炎症中发挥作用；而无论喘息患儿在喘息发作时还是在喘息停止后的痰液中，Mar比例均减少，是因为采用构成比，痰液其他细胞的增多必然使巨噬细胞相对减少，但是否存在其他机制尚需进一步研究。近年来国外有研究[16]表明，中性粒细胞浸润性炎症也是哮喘气道炎症中一种重要类型，使人们对中性粒细胞的致病作用愈发重视。在重症哮喘和哮喘急性发作时，中性粒细胞的作用甚至已超过传统意义的嗜酸性粒细胞[17-18]。DOUWES等[19]分析文献发现，中性粒细胞性哮喘在轻、中度哮喘中也较普遍。虽然对于中性粒细胞在哮喘气道炎症中的作用和地位尚未完全明确，但对于

其在喘息发病过程中的作用，较为统一的认识是其合成并释放的弹性蛋白酶为促进气道黏液腺分泌的主要刺激物之一[20]。活化的中性粒细胞能够通过释放炎症介质造成组织炎症损伤，且其介质能增加支气管组织对刺激的反应性。本研究结果显示，在喘息发作时，喘息各组明显高于喘息停止后的喘息各组及对照组（P＜0.01），说明中性粒细胞为急性气道炎症的主要效应细胞之一，进一步证实喘息发作时气道炎症的多样性。在喘息停止后，喘息Ⅰ组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），喘息Ⅱ组其Neu比例仍较高，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），而与支气管哮喘组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示反复发作的喘息性支气管炎和支气管哮喘之间或许存在部分相同的发病机制，可能与中性粒细胞有一定的密切关系。或是与本组病例在喘息发作停止后3～5 d，与发作期的间隔时间较短，作为急性气道炎症的主要效应细胞之一的中性粒细胞尚未完全凋亡有关。

由于儿童哮喘在发病机制与病理生理上与成人哮喘存在差异，何种细胞在儿童哮喘中扮演最重要的角色尚无定论。如能针对不同的表型采取针对性的措施可能会取得更好的疗效。因此检测痰液细胞计数显得尤为重要。

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（张蕾 编辑）

Clinical significance of inflammatory cells in induced sputum of wheezy children

Li-li DENG1,Xiao HE2,Ye-fei LEI1,Kang-jie LI2,Qi-liang XIAO3
(1.Department of Paediatrics,Children's Hospital Affiliated to the First People's Hospital of Chenzhou,Chenzhou,Hunan 423000,P.R.China;2.Department of Orthopedics,the First People's Hospital of Chenzhou,Chenzhou,Hunan 423000,P.R.China;3.Department of Paediatrics,the Second Affiliated Hospital,South China University, Hengyang,Hunan 421001,P.R.China)

【Objective】To explore the ratios of inflammatory cells in induced sputum of wheezy children and analyze the significance.【Methods】Thirty cases with asthma and ninety cases with asthmatic bronchitis were enrolled into this study.The patients with asthmatic bronchitis were randomly divided into wheezingⅠgroup and wheezingⅡgroup according to the frequency of wheezing attack,while the later was subdivided into wheezingⅡa group and wheezingⅡb group according to the duration of wheezing attack from the first time to the last time.There were thirty cases in each of the three groups which were enrolled as observed groups. In the same period of time,thirty healthy volunteers were into control group.Inflammatory cells such as neutrophils,eosinophils and lymphocytes were detected by means of induced sputum in all the above groups.

asthma;asthmatic bronchitis;induced sputum;inflammatory cell

R725.6

B

1005-8982（2015）24-0061-05

2015-02-16

【Results】Eosinophil cell ratio:The ratio at wheezing attack in each wheezing group was higher than that in the control group and each wheezing group after wheezing attack(P＜0.01).The eosinophil ratio of the wheezingⅠgroup was much lower than that of the wheezingⅡgroup(P＜0.01),and the wheezingⅡa group had a lower proportion than the wheezingⅡb group(P＜0.01).There was no significant difference between the wheezingⅡb group and the asthma group(P＞0.05).When wheezing stopped,the eosinophil ratio of the wheezingⅠgroup was markedly decreased and had no significant difference from that in the control group(P＞0.05).Meanwhile,the ratio of the wheezingⅡb group kept high and had a significant difference from that of the control group(P＜0.01)but no statistical difference from that of the asthma group(P＞0.05).Neutrophil cell ratio:The ratios of the wheezing groups at wheezing attack were much higher than those of the control group and the wheezing groups after wheezing attack and the differences were significant(P＜0.01).After wheezing attack,there was no obvious difference between the wheezingⅠgroup and the control group(P＞0.05)while the ratio of the wheezingⅡgroup remained high with a significant difference from that of the control group(P＜0.01),but without a significant difference from that of the asthma group(P＞0.05).The difference between the wheezingⅡa group and the wheezingⅡb group was not significant(P＞0.05).Lymphocyte cell ratio:At wheezing attack no evident differences were found between all the wheezing groups and the control group(P＞0.05).On the contrary,when wheezing stopped,each wheezing group had a significantly higher neutrtophil proportion than the control group and each wheezing group at wheezing attack(P＜0.01).The wheezingⅡgroup had a higher proportion than the wheezingⅠgroup(P＜0.01)while had no significant difference with the asthma group(P＞0.05).【Conlusions】Combined with to clinical history,dynamic observations on the ratios of inflammatory cells may be of some value in the early diagnosis and treatment of asthmatic bronchitis which may develop into bronchial asthma.