miR-224对hep3B细胞增殖和凋亡的影响

毛英，陈保华，李新建，姚斌

鹰潭市解放军第一八四医院普外科，江西 鹰潭 335000

微小RNA分子(miRNA)是一种内源性的非编码小分子RNA，广泛分布于动植物细胞体内，大量研究发现miRNA在恶性肿瘤细胞的发生、发展中发挥重要作用，其中包括调控细胞的增 殖、分化和凋亡［1-2］。近年研究报道miR-224在肝细胞 癌、肠癌等恶性肿瘤中呈过表达且与恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关［3-5］。然而miR-224表达对Hep3B细胞增殖与凋亡的影响研究尚未见报道。在本实验中我们采用TagMan MGB探针法检测miR-224在Hep3B细胞中的表达情况，同时利用反义寡核酸技术(antisense oligonucleotide，ASO)抑制miR-224在Hep3B细胞中的表达，分析miR-224对Hep3B细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料 和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和细胞

Hep3B细胞由本实验室保存，实验动物Bal B/C裸鼠，4～5周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于SPF无菌环境下。

1.1.2 主要试剂和仪器

TaqMan miRNA分析试剂盒购自美国ABI公司，DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司、胎牛血清购自美国Hyclone公司，脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，反义miR-224寡核苷酸(miR-224 ASO)购自宝生物工程(大连)有限公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，总蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，鼠抗人Bcl-2单克隆抗体购自美国santa cruz公司，实时荧光定量PCR分析仪购自美国ABI公司, 流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR检测miR-224的表达

采用TRIzol试剂提取Hep3B细胞miR-224 ASO转染组及对照组织中总RNA，采用紫外分光光度计测定浓度，-80 ℃保存，运用miR-224检测试剂盒检测miR-224的表达。首先取2 μg总RNA为反应模板与3 μL反转录酶相互混合，反应体系为20 μL，反应条件为：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反应结束后，收集cDNA，将其稀释150倍，然后取1 μL稀释的cDNA与2 μL TaqMan引物相混合，20 μL反应体系：95 ℃ 10 min，随后95 ℃ 15 s，59 ℃ 60 s，40个循环。相对miRNA表达采用ct值精确计算，将U6 snRNA作为内参。

1.2.2 反义miR-224单核苷酸序列设计

MiRBase(http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna)提供的miRNA基因序列，获取人miR-224的序列，并设计其反义寡核苷酸序列，同时运用核酸序列数据库检索程序以排除其他的同源序列。另外，我们同时设计一条随机对照序列，miR-224顺义链：5’-AGUCACUAGUGGUUCCGUUUA-3’，反义链：5’-TAAACGGAACCACTAGTGACT- 3’；随机序列顺义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU TT-3’，反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3’， 送Invitrogen公司合成，PAGE纯化，全硫代修饰。

1.2.3 细胞培养和反义寡核苷酸转染

将Hep3B细胞接种于DMEM培养基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃，CO2体积分数为5%的条件下培养。严格遵照LipofectamineTM2000转染试剂盒操作程序进行转染，反义miR-224寡核苷酸终浓度分别为50、100、150和200 nmol/L，我们前期初步筛选出最佳终干扰浓度为100 nmol/L。转染后培养时间分别为24、48和72 h，初步筛出最佳作用时间为48 h。将荧光对照的反义寡核苷酸转染后置于倒置荧光显微镜下进行观察，上述操作重复3次。转染效率为(88.5±6.4)%。

1.2.4 转染miR-224 ASO后对miR-224表达的影响

转染miR-224 ASO与对照ASO 48 h后，提取总RNA， 测定浓度，逆转录为cDNA(反应条件同1.2.1)，测定cDNA浓度。运用miR-224检测试剂盒检测miR-224的表达(具体条件同1.2.1)。

1.2.5 克隆形成实验检测Hep3B细胞的增殖

Hep3B细胞经转染后，取对数生长期的细胞，用含3%胰蛋白酶消化细胞。接种于6孔培养板中，大约500～600个细胞/孔，置37 ℃，CO2体积分数为5%，饱和湿度的条件下，培养2～3周。观察细胞生长情况，当培养皿中出现肉眼可见的克隆细胞团时，终止培养。移去上清液，运用PBS漂洗2次。加甲醇固定20 min，去除固定液，加适量Giemsa应用染色液染30 min，用ddH2O清洗染色液，经干燥后在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.6 MTT检测Hep3B细胞增殖情况

收集H e p 3 B 细胞，将各组细胞悬液在离心管内反复充分打匀，接种于9 6 孔培养板(6×103/孔)，24 h后换液。实验分组同1.2.4，每组设有6个复孔。转染后1～4 d每孔加入MTT试剂(浓度为5 mg/mL)20μL，置于37℃、CO2体积分数为5%条件下继续温育4 h。用移液器吸取各孔上清液，加入DMSO 150 μL/孔，在室温条件下摇10 min(置水平摇床)以充分完全溶解MTT结晶。测定各孔吸光度(D490nm)值。每组重复3次。按下列公式计算细胞生长抑制率(%)：细胞生长抑制率=(D490nm实验组平均-D490nm对照组平均)÷D490nm对照组平均×100%。

1.2.7 活体内检测miR-224 ASO对Hep3B细胞增殖的影响

将18只(4～5周龄)裸鼠(购自上海斯莱克公司)饲养于SPF无菌环境下。Hep3B细胞稳定转染对照ASO或miR-224 ASO后，取对数期生长的细胞(约2×106个)制成150 μL细胞悬液，运用微量注射器接种于裸鼠左侧大腿背部皮下。成瘤后定期测量肿瘤的大小，并运用公式(V=D×d2×π/6)(D，d分别代表肿瘤的最大直径和最小直径)计算肿瘤的体积［6］，绘制肿瘤生长曲线。饲养6周后处死裸鼠，取瘤称重。经福尔马林固定、石蜡包埋、HE染色后，在光镜下观察肿瘤组织的病理学特征。

1.2.8 流式细胞术分析细胞早期凋亡

实验分组同1.2.4，将细胞接种于6孔板中， 转染反义miR-224寡核苷酸。经48 h后收集细胞并制备为单细胞悬液，采用PBS漂洗2次，离心、弃上清液。最后运用Annexin V-FITC早期凋亡试剂盒和流式细胞仪检测各组细胞的早期凋亡情况。

1.2.9 检测各组细胞Bcl-2 mRNA的表达水平

各组培养细胞加入TRIzol裂解液，提取总RNA，逆转录为cDNA，运用SYBR Green Real Time PCR Master Mix通过实时荧光定量 PCR方法检测Bcl-2 mRNA的表达。Bcl-2基因的引物序列为上游： 5’-AACTGGGGGAGGATTGTGGC-3’；下游：5’-GATCCAGGTGTGCAGGTGCC-3’。反应条件：95 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以GAPDH作为内参。在ABI7500反应平台上进行PCR反应。

1.2.10 检测各组细胞Bcl-2蛋白的表达水平

收集转染miR-224 ASO的Hep3B细胞，运用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，经10%SDSPAGE电泳后转膜，将膜放在含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中37 ℃封闭2 h，加一抗稀释液 1∶500稀释鼠抗人Bcl-2单克隆抗体在4 ℃温育过夜，1×TBST缓冲液洗膜10 min×3次，加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释)，置于37 ℃温育2 h，1×BST缓冲液洗膜10 min×3次，运用ECL化学发光法检测目的蛋白条带。以β-actin作为内参。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料以(±s )表示，两组间均数的比较采用Student’s t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hep3B细胞miR-224的表达情况

利用实时荧光定量PCR检测miR-224 ASO转染组和对照组，结果发现：miR-224 ASO转染组miR-224的表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

2.2 降低miR-224的表达对Hep3B细胞存活率的影响

转染miR-224 ASO后，通过荧光定量PCR方法检测发现miR-224的表达较对照明显降低(P<0.05，图2A)。同时MTT检查结果发现：转染miR-224 ASO后组细胞生长较对照组明显降低，两者差异有统计学意义(P<0.05，图2B)。

2.3 降低miR-224的表达对体外Hep3B细胞增殖的影响

克隆形成实验结果提示：miR-224ASO转染后，Hep3B细胞克隆形成率较对照明显降低(P<0.05，图3)。

2.4 降低miR-224的表达对活体肿瘤增殖的影响

本实验所有的裸鼠肿瘤成瘤率为100%，实验结果发现miR-224 ASO稳定转染组的肿瘤生长较对照组明显慢，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

2.5 降低miR-224的表达对Hep3B细胞凋亡的影响

Hep3B转染miR-224 ASO后，流式细胞仪检测细胞凋亡的结果显示：Hep3B细胞在转染miR-224 ASO后，凋亡增加明显，而对照ASO转染后凋亡无明显变化(P<0.05，图5)。

图1 实时荧光定量PCR检测miR-224 的表达Fig. 1 miR-224 mRNA expression detecting by qRT-PCR

图2 转染miR-224 ASO后，Hep3B细胞miR-224的表达和生长情况变化Fig. 2 Hep3B cells proliferation (A) and expression mRNA level (B) miR-224 of after transfection

图3 转染miR-224 ASO后，Hep3B细胞克隆形成率明显降低Fig. 3 Colony formation rate of Hep3B cells after transfection

图4 活体内miR-224ASO转染的Hep3B细胞致瘤的体积变化Fig. 4 The volume of nude mice tumors after transfection

图5 流式细胞仪检测miR-224 ASO转染后的Hep3B细胞凋亡情况Fig. 5 Hep3B cells apoptosis after transfection detecting by MTT

2.6 降低miR-224的表达对Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表达的影响

miR-224 ASO转染Hep3B细胞后，利用荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞中Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表达水平，结果发现miR-224 ASO组Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表达水平明显低于对照ASO转染组，两者差异有统计学意义(P<0.05，图6)。

图6 Bcl-2 mRNA和蛋白在转染miR-224 ASO 的Hep3B细胞中的表达情况Fig. 6 Bcl-2 expression at protein level and mRNA level after transfection

3 讨 论

miRNAs是一类新的调控因子，在控制细胞的生长发育、分化、血管形成和凋亡等过程中发挥着十分重要的作用［7-8］。miRNA通过与靶mRNA的3’非编码区近乎完全互补结合在转录后水平使其降解, 或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用。随着越来越多的miRNA被鉴定和深入研究，近年来研究发现miRNAs与恶性肿瘤关系密切，大约有调控miRNAs编码基因位的52%位于肿瘤相关染色体区域［9-10］。有研究者认为miRNA 实际上可作为癌基因或者抑癌基因而发挥作用。因此，miRNAs可能成为诊断肿瘤新的分子标志和判断肿瘤治疗及预后的分子靶点，且miRNAs在转录后水平调节靶基因表达，更有助于恶性肿瘤的早发现、早诊断和早治疗，其必将具有广阔的临床应用前景［11］。

原发性肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，侵袭转移快，死亡率很高。肝细胞癌早期症状不典型，肝移植效果好，肝脏来源有限，费用高。手术并不能最终解决肝癌侵袭转移性问题。因此，发现肝细胞癌的早期诊疗标记物和治疗靶点具有重要意义。近年随着miRNAs研究的不断深入，发现包括miR-122、miR-21、miR-224等在内的多个MicroRNA的异常表达与肝癌的发生、发展密切相关，多个MicroRNA参与了肝癌的增殖、分化、凋亡和死亡等一系列过程［12］。Li等［13］发现miR-224在肝癌细胞HepG2中表达上调且参与细胞的侵袭和转移。最近Ding等［14］研究发现miR-224通过HOXD10影响肝癌细胞Hep3B细胞迁移，但miR-224对肝癌Hep3B细胞增殖、凋亡的作用尚不清楚。

我们首先利用实时荧光定量PCR检测转染miR-224 ASO与对照组Hep3B miRNA表达，结果发现miR-224在转染组中受到明显抑制，两者差异有统计学意义。这表明miR-224在肝细胞癌的发生、发展中可能发挥重要作用。目前有大量研究针对目的miRNA设计相应的ASO来研究miRNA在细胞中的生物学功能［16-17］。为了进一步分析miR-224对Hep3B细胞功能的影响，我们首先通过转染miR-224 ASO降低Hep3B细胞中miR-224的表达，同时利用MTT方法检测降低miR-224的表达后Hep3B细胞生长情况，结果发现转染miR-224 ASO的Hep3B细胞存活率明显降低。此外，我们运用克隆形成实验还观察到转染miR-224 ASO后，Hep3B细胞克隆形成率比对照ASO组明显减少。同时我们在活体内实验进一步证实稳定转染miR-224 ASO组Hep3B细胞皮下形成肿瘤的体积减小较对照ASO组显著。这都表明miR-224在骨肉瘤细胞生长中起着非常重要的作用。

本研究结果还发现转染miR-224 ASO组Bcl-2 mRNA和蛋白水平明显下降。这表明miR-224可能通过调节Bcl-2表达而影响细胞凋亡，从而达到对肿瘤细胞增殖能力的调控。

综上所述，miR-224在调控Hep3B的增殖和凋亡方面发挥重要作用，其很可能成为一个肝细胞癌新的癌前标志物，为肝细胞癌临床基因治疗提供新的靶点。

［1］CROCE C M, CALIN G A. miRNAs cancer, and stem cell division［J］. Cell, 2005, 122 (1): 6-7.

［2］CHEN C Z, LI L, LODISH H F, et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation［J］. Science, 2004, 303 (5654): 83-86.

［3］MURAKAMI Y, YASUDA T, SAIGO K, et al. Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues ［J］. Oncogene, 2006, 25: 2537-2545.

［4］OBERG A L, FRENCH A J, SARVER A L, et al. miRNA expression in colon polyps provides evidence for a multihit model of colon cancer ［J］. PLoS One, 2011, 6: e20465.

［5］LI Q, WANG G, SHAN J L, et al. MicroRNA-224 is upregulated in HepG2 cells and involved in cellular migration and invasion ［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2010, 25: 164-171.

［6］ZHANG W, RAN S, SAMBADE M, et al. A monoclonal antibody that blocks VEGF binding to VEGFR2 (KDR/Flk-1) inhibits vascular expression of Flk-1 and tumor growth in an orthotopic human breast cancer model［J］. Angiogenesis, 2002, 5 (1-2): 35-44.

［7］CROCE C M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer［J］. Nat Rev Genet, 2009, 10: 704-714.

［8］STEFANI G, SLACK F J. Small non-coding RNAs in animal development［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9: 219-230.

［9］WANG Y, LEE C G. Role of miR-224 in hepatocellular carcinoma: a toll for possible therapeutic intervention ［J］. Epigenomics, 2011, 3(2): 235-243.

［10］ZHANG Y, TAKAHASHI S, TASAKA A, et al. Involvenment of microRNA-224 in cell proliferation, migration, invasion and anti-apoptosis in hepatocellular carcinoma［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28(3): 565-575.

［11］JEMAL A, SIEGEL R, WARD E, et al. Cancer statistics, 2008 ［J］. CA Cancer J Clin, 58: 71-96.

［12］WANG Y, LEE A T, MA J Z, et al. Profiling microRNA expression in hepatocecllular carcinoma reveals microRNA-224 up-regulation and apoptosis inhibitor-5 as a microRNA-224-specific target［J］. J Biol Chem, 2008, 283: 13205-13215.

［13］LI Q, WANG G, SHAN J L, et al. MicroRNA-224 is upregulated in HepG2 cells and involved in cellular migration and invasion ［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2009, 25: 164-171.

［14］DING C C, LI Q, WANG G, et al. miR-224 promotes cell migration by targeting HOXD10 in Hep3B cells［J］. J Third Mil Med Univ, 2014, 13: 1365-1366.

［15］PRUEITT R L, YI M, HUDSON R S, et al. Expression of microRNAs and protein-coding genes associated with perineural invasion in prostate cancer ［J］. Prostate, 2008, 68: 1152-1164.

［16］HUANG L, TING D, LIN X, et al. miRNA-224 targets RKIP to control cell invasion and expression of metastasis genes in human breast cancer cells ［J］. Biochem Biophy Res Commun, 2012, 425(2): 127-133.

［17］LEE Y S, KIM H K, CHUNG S, et al. Depletion of human microRNA miR-125b reveals that it is critical for the proliferation of differentiated cells but not for the downregulation of putative targets during differentiation ［J］. J Biol Chem, 2005, 280 (17): 16635-16641.