RT-PCR Array技术筛选膀胱癌癌症相关信号通路基因的表达变化

杨珂，傅斌,2，王义兵，王共先,2，李军华，刘仁升，齐雪亮，黄亮

1.南昌大学第一附属医院泌尿外科，江西 南昌330006；

2.江西省泌尿外科研究所，江西 南昌 330006

近年来，随着分子生物学的发展，现代医学对膀胱肿瘤的认识已从整体水平发展到细胞、分子水平。其中有关信号通路与膀胱癌生物学行为的研究已经成为热点并取得了一定的成果。因此，研究与膀胱癌相关信号通路的关键基因的mRNA的表达对研究膀胱癌具有重要意义。

本研究应用德国Qiagen公司Human Cancer Pathway Finder PCR Array板，阵列配置84个基因代表参与影响肿瘤的9种不同的生物信号通路表达，包括：细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤修复、细胞衰老、端粒维持、新陈代谢、血管生成、细胞缺氧及上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，并通过qRT-PCR验证，探究其通过对信号通路的影响与膀胱癌发生、发展的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本收集

在符合临床研究伦理道德标准的情况下，收集2014年3月—5月南昌大学第一附属医院泌尿外科经病理诊断为膀胱癌组织标本及其周围正常组织各27例，纳入本实验膀胱癌标准为：分期T2～4a，N0-X，M0，手术方式为膀胱根治性切除的患者，通过前期实验发现根治性手术对标本影响较小，可以更为完整地提取总RNA。收取膀胱癌组织和癌旁5 cm以上的正常组织， 在保障病理学检测所需标本的前提下，尽量提供足量的肿瘤和癌旁正常组织，一般不少于200 mg或107个细胞［1］。液氮速冻保存。

1.1.2 实验仪器

液氮罐(上海金凤五金塑胶有限公司)，-80 ℃冰箱(德国Siemens公司)，-20 ℃冰箱(中国青岛海尔股份有限公司)，电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，分光光度计(美国Thermo公司)，荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，高速离心机(德国Eppendorf公司)，移液器(德国Eppendorf公司)。

1.1.3 实验试剂

QIAzol(德国Qiagen公司)，RNeasy Mini Kit试剂盒(德国Qiagen公司)，Rt2 First Strand试剂盒(德国Qiagen公司)，PrimeScript RT reagent Kit(宝生物工程(大连)有限公司)，SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit (宝生物工程(大连)有限公司)，SNAI3、GSC、KRT14、DSP、SNAI2和β-actin引物(北京全式金生物技术有限公司)，其他试剂：氯仿、异丙醇、溴化乙锭、TBE电泳缓冲液(50×)、琼脂糖等。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取

在实验前应准备好DEPC水处理好的研钵及枪头，并戴好口罩、帽子，避免RNA酶污染。采用冰冻切片，用HE染色的方法来定性膀胱癌组织及正常膀胱组织，取两组不多于100 mg组织(尽量保持组织处于冷冻状态)，用研钵磨碎至粉末状，加入QIAzol Lysis Reagent 1 mL混匀。采用RNeasy Mini Kit试剂盒提取总RNA。

1.2.2 RNA浓度和质量检测

用分光光度仪分析RNA浓度和纯度，将溶解于无核酶水中的RNA置于冰盒中，并用2 μL无核酶水作对照基线，取2 μL RNA溶解液，测浓度。合格的RNA样本应该满足D260∶D230比值大于1.7，D260∶D280比值在1.8和2.0之间，D260测出的浓度必须>40 μg/mL。RNA琼脂糖凝胶电泳测RNA的完整性，制作1%琼脂糖凝胶，将RNA进行电泳。

1.2.3 cDNA合成

使用RT First Strand Kit合成cDNA，解冻RT First Strand Kit的试剂。用简短离心15 s，使管中的试剂沉至管底。保持在42 ℃ 15 min，然后放入95 ℃保持5 min。将反应物中加入91 μL无RNA酶水，用加样枪混匀。

1.2.4 荧光定量PCR反应

简短离心10～15 s把RT SYBR Green Mastermix试管中试剂沉至管底。可在室温下进行。在96孔板中加入PCR反应混合物，每孔25 μL。每一步骤使用新的加样枪头，避免孔间污染。透光黏性密封膜密封96孔板。在室温下离心去除气泡。设定Applied Biosystems，把Cancer Pathway Finder PCR Array板放在实时PCR仪中。开始PCR实验。

1.2.5 标本验证

按表1设计合成引物，实时荧光定量PCR验证，将所收集的膀胱癌患者组织及正常组织，以及膀胱癌细胞株5637、J83和T24，使用上文所述方法提取RNA，并使用PrimeScript RT Reagent Kit逆转录成cDNA，并使用SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit进行实时荧光定量PCR。

1.3 统计学处理

采用 SPSS 21.0 统计软件对实验结果的数据进行统计分析， 计量数据以±s 表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 冰冻切片

对膀胱癌组织和正常膀胱组织做冰冻切片，HE染色结果见图1。

2.2 RNA质量检测

所有样品用紫外分光光度计法测定D260和D280，D260∶D230>1.9，D260∶ D280值均在1.8～2.0之间。并取5 μL总RNA溶液经甲酵变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA完整性，在紫外线下可见18 s及28 s两条明亮清晰的条带(图2)。

图1 膀胱癌组织和正常膀胱组织冰冻切片Fig. 1 Bladder cancer tissues and normal bladder tissue

表1 qRT-PCR引物序列及反应条件Tab. 1 The primer sequence and reaction condition of qRT-PCR

图2 膀胱癌组织和正常组织总RNA电泳图Fig. 2 Total RNA agarose gel electrophoresis of bladder cancer tissues and normal bladder tissue

2.3 RT-PCR Array数据分析结果

所提取总RNA使用Rt2 First Strand试剂盒逆转成cDNA，并行qRT-PCR反应，获得了所有通路84个关键基因及内参基因的Ct值，并对其作lg2-ΔCt，同时对数据应用GraphPad Prism 6进行统计学分析(图3)。当膀胱癌和正常组织表达差异越小时数据越靠近一、三象限等分线，因此越偏离等分线则表达差异越大。据此，得到显著上调基因8个，显著下调基因19个。本研究选择影响EMT的信号通路作为研究方向，可见GSC、KRT14和DSP基因上调，SNAI2、SNAI3基因下调(图4)。

2.4 qRT-PCR验证结果

对筛选出的兴趣基因：GSC、KRT14、DSP、SNAI2、SNAI3基因，进行多病例验证，以及在3种膀胱癌细胞株5637、J83及T24上进行验证，验证RT-PCR Array中得出的结果是否可靠。对上述多次qRT-PCR所得数据进行分析(图5)。上调基因中，GSC在验证的癌组织与肿瘤细胞株中表达均低于正常组织，但差异无统计学意义，该结果与H u m a n Cancer Pathway Finder PCR Array实验结果不一致；而K R T 1 4、D S P 基因在膀胱癌中表达显著高于正常组织(P ＜0.0 5)，下调基因SNAI2、SNAI3在膀胱癌中表达显著低于正常组织(P＜0.05)，且以SNAI3表达差异最显著。

图3 膀胱癌组织与正常膀胱组织行Human Cancer Pathway Finder PCR Array所得ΔCt值的分布Fig. 3 Distribution of ΔCt values of bladder cancer tissues and normal bladder tissues resulted from Human Cancer Pathway Finder PCR Array

图4 根据RT-PCR Array检测筛选基因的mRNA表达水平Fig. 4 mRNA relative expression of genes that was screened in bladder cancer by RT-PCR Array

图5 对所选基因在多样本和膀胱细胞株中进行qRT-PCR验证所得的mRNA表达水平分布情况 Fig. 5 The distribution of 2-ΔΔCt of the screened genes by repeating qRT-PCR

3 讨 论

膀胱肿瘤是严重威胁人类健康的重要疾病之一［2］，也是泌尿外科最常见肿瘤［3-4］，因此，在基因水平上研究膀胱癌发病具有重要意义。本研究从影响肿瘤的9个方面信号通路中筛选出可能与膀胱癌相关的关键基因作为兴趣基因，来探究膀胱癌发生、发展的机制，并希望通过本研究为膀胱癌的预防及治疗提供新思路。通过RT-PCR Array技术筛选出具有表达差异的影响EMT信号通路的基因作为兴趣基因：GSC、KRT14、DSP、SNAI2、SNAI3基因，经多样本qRT-PCR验证：KRT14、DSP基因在膀胱癌中表达显著高于正常组织(P＜0.05)，SNAI2、SNAI3基因在膀胱癌中表达显著低于正常组织(P＜0.05)，其中以SNAI3基因膀胱癌 组织和正常膀胱组织表达差异最大。

KRT14属于角蛋白编码家族，其对上皮组织早期发育有重要影响［5］，此外KRT14还可能参与维持细胞增殖潜力，并可以调节Notch-1依赖性细胞分化［6］，Notch信号通路通过对EMT的诱导而影响肿瘤已经得到广泛证实［7-8］。本研究中KRT14在膀胱癌组织中表达高于正常组织，KRT14在膀胱癌发生、发展中可能通过上述通路发挥作用。DSP可以抑制Wnt/β-catenin信号通路［9］，而Wnt/β-c atenin信号通路在人类众多肿瘤中起到重要作用已经得到广泛证实［10］，与此同时Wnt/β-catenin信号通路还能通过影响EMT进程来影响肿瘤发生［11］，其在膀胱癌中表达高于正常组织，因此，其可能通过上述作用影响膀胱癌发生进程。SNAI3作为转录因子参与E-cadherin的转录［12］，而E-cadherin的缺失是发生EMT的主要标志［13-14］，SNAI3表达的抑制而促使正常膀胱黏膜上皮E-cadherin 的缺失而发生EMT，因此，SNAI3可能通过影响EMT来影响膀胱组织癌变进程。本研究qRTPCR验证显示(图4)，在膀胱癌组织中SNAI3的表达受到抑制而明显低于正常组织，可以推断SNAI3的表达对维持正常膀胱组织对抗EMT有重要意义，SNAI3表达的缺失可能诱导EMT的发生。

本研究通过对大量基因进行筛选及验证，推测KRT14、DSP和SNAI3基因可能与膀胱癌发生、发展及转移有密切关系，并值得采用进一步的体内或体外实验方法对其作用机制深入研究，可能为基因治疗膀胱癌提供重要靶点。

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