DNA测序仪应用性相关指标初探

荣海博 赵颖 俞丽娟 管桦

(公安部第一研究所 北京 100048)

毛细管电泳是80年代后期迅速发展起来的一项新的电泳分离技术,其具有DNA样品加样自动化、高效快速、定量准确及样品用量微量等优点。基于毛细管凝胶电泳-激光激发荧光技术研制的DNA测序仪已成为法医DNA检验的常规检验仪器[1]。

DNA测序仪由中央控制系统、注胶系统、光学系统、运动控制平台、温度控制系统、毛细管高压电泳系统和数据收集系统组成,只有当每个系统保持良好的运行状态以及各系统之间良好的相互协调,才能获得完整且正确DNA检验结果[2]。如下图所示：

因此,本文根据以往的实验经验和现有的文献资料从DNA测序仪的空间校正、光谱校正、电泳过程监测数据、单碱基分辨力和电泳结果重现性等方面建立DNA测序仪应用性相关指标并进行论述,以期为DNA测序仪的应用性能评价提供参考。

1 DNA测序仪应用性能指标

1.1 空间校正 spatial calibration

1.1.1 空间校正

空间校正即毛细管阵列在检测窗口受激光激发产生的荧光信号落在CCD上的位置,建立每个毛细管发出的信号和信号落点位置之间的关系。其作用就是确定16根毛细管在CCD检测器上的纵向最佳读取位置并且可直接反映出激发光路状态和CCD采集性能。

1.1.2 如何评价空间校正是否成功

评估定位结果,每根毛细管均有信号且呈单一尖峰;相邻两个峰像素差值在13-16之间(如图1)。若不满足则空间校正失败(如图2)。

图1 成功的空间校正结果

图2 失败的空间校正结果

1.2 光谱校正spectral calibration

1.2.1 光谱校正

DNA测序仪对STR进行分型采用的是多色荧光检测系统,其本质是不同的荧光素在其中心发射波长出的信号。在DNA测序仪中,使用面阵CCD进行光谱采集,面阵CCD高250像素,宽512像素,图3中央显示了毛细管的光谱到CCD上的映射关系,图中,毛细管编号为①②......,每个毛细管的光谱展开到CCD上都是一个长条型的空间,选一个长条形空间放大,如图4所示,每个bin大小为3×14,一根毛细管的光谱展开占用20个bin,这样一个长条型的空间的大小将为3×(14×20)=3×280,单位均为像素。

图3 光谱采集用的面阵CCD

图4 一根毛细管对应的一组bin

图5 荧光标准物的光谱分布

图6 成功的光谱校正

图7 失败的光谱校正

图8 电泳过程监测数据

图9 186bp和187bp电泳分离结果

光谱校正主要是解决一个光谱空间到染料空间的一个映射问题。STR分型中,一般会采用四种或五种荧光染料(即染料空间)去标记片段长度不同的基因座,在特定时间检测到某种荧光就意味着检测到某个特定基因座,但是实际情况是荧光染料的光谱空间一般都比较大,以在STR分型中常用的5-FAM,JOE,NED,ROX四种荧光染料为例,它们的光谱范围都比较宽,以JOE为例,它的光谱范围就跨越了520—640nm的光谱空间,这样当用JOE标记的某种基因座出现时,整个光谱空间都能检测到荧光,依次为蓝色、绿色、黄色、红色(光谱空间),如果直接采集染料发生的光谱,任何一种染料标记的碱基过来我们都能在蓝色、绿色、黄色、红色(光谱空间)上检测到强弱不一的信号,这样会导致基因座识别无法进行。实际上,这就是染料空间到光谱空间的映射问题,因为染料空间到光谱空间不是一一映射关系,所以不能直接用光谱空间来分辨四种染料,如果4种荧光染料发的荧光都具有激光一样的单色性,如5-FAM只发540nm的蓝光,那么染料空间到光谱空间将是一一映射的关系,那样的情况下光谱将不需要进行光谱校正(如图5)。

因此,光谱校正能否成功,是评价激发系统、分光系统和数据采集系统性能的重要指标。

1.2.2 如何评价光谱校正是否成功

以ABI DS-33光谱校正试剂为例,每根毛细管质量数Q值大于0.95,条件数C值在8.5-14.5之间,绿色圆点表示光谱校正通过(如图6)。若未达到Q值及C值的显示为红色圆点则表示光谱校正失败(如图7)。

表1 电泳过程监测数据参数范围

图10 500bp和501bpDNA片段的分离结果

1.3 电泳过程监测数据electrophoresis trace data

电泳过程监测数据是监测电泳整个过程中的环境温度、CCD温度、CellHeater温度、EPT电流、EPT电压、激光器电流、激光器功率和恒温箱温度等各系统运行参数数据,其中除环境温度以外的参数均为DNA测序仪器性能的重要指标(如图8)。

电泳过程中的每个参数的固定范围值(如表1)。

(1)CCD温度。CCD温度显示当前电泳过程中CCD的温度值,其范围为-10℃～-9.8℃,CCD温度曲线应呈直线状。

(2)CellHeater温度。CellHeater温度表示恒温箱加热板的温度,其变化范围为68℃~80℃,在恒温箱温度上升时,CellHeater温度呈曲线变化,待恒温箱温度稳定后,CellHeater温度保持恒定,CellHeater曲线呈平滑直线状。

(3)恒温箱温度。恒温箱温度表示恒温箱内的温度值,在恒温箱温度上升时,曲线呈平滑上升状,温度稳定后曲线呈平滑直线状。恒温箱温度保持平稳后,其温度值要与软件设定的温度一致,通常STR电泳的恒温箱温度保持在60℃。

(4)EPT电压。EPT电压表示当前电泳电压值,EPT电压值要与软件设定的电压值一致,通常STR电泳的EPT电压值设定为15kv。

(5)EPT电流。EPT电流表示电泳过程中电泳通路内的电流值,EPT电流会受到ETP电压、缓冲液离子浓度和凝胶电导率等因素影响。当EPT电压为15kv时,EPT电流值范围为130uA～180uA。

(6)激光器电流。激光器电流表示电泳过程中激光器当前的电流值,在电泳过程中,激光器电流保持恒定,其变化范围为4.0A～6.5A。

(7)激光器功率。激光器功率表示电泳过程中激光器的功率,激光器功率的大小由激光器电流和电压大小决定,DNA测序仪中激光器功率一般保持在14.5mW～15.1mW。如果激光器功率过高,会增大激光器的损耗,进而降低DNA测序仪的使用寿命,激光器功率过低会降低荧光激发效率,影响电泳数据采集及STR分型的结果。

1.4 单碱基分辨力single base resolution

单碱基分辨能力指DNA测序仪能否成功分离带有相同荧光素标记的长度相差1bp的两个DNA片段。

在法医DNA鉴定中,STR基因座扩增片段一般在500bp以下,相同STR基因座扩增片段长度最小可以相差1bp(如图9),因此DNA测序仪能否成功分离相差1bp的相邻DNA片段成为检测仪器性能的重要指标,同时可对电泳过程中电压的稳定性、激光激发效率、CCD数据采集精度等方面进行监测。

市场上用于检测分辨力的标准品通常是ABI公司的Allelic Ladder。Allelic Ladder中含有186bp和187bp两个相差1bp的DNA片段,在法医鉴定检测中,大多根据这两个片段的分离情况来初步检验仪器是否满足STR分型所需的分辨力要求,如图9。本项目组曾成功设计了带有6-FAM荧光标记的500bp和501bp的DNA片段,并在自主研制的DNA测序仪上成功进行了电泳分离,验证了该仪器满足了测序仪单碱基分辨力的指标,如图10[3][4]。

1.5 电泳结果均一性electrophoresis homogeneity

STR电泳时,样品中都要加入size standard作为分子量内标,分型软件在定义分子量内标的时候,250bp有意未作定义,这样就可以通过计算确定该片段的实际大小,一般情况下都是246左右,它可以作为一个标志,只有该值相差不到1bp时,才认为16根毛细管中样品的电泳迁移速率是一致的,因此其可用于判定电泳过程中16根毛细管电压电流的一致性,恒温箱温度的均衡性。

2 结语

DNA测序仪是当前法医DNA检验技术中重要的检验仪器,具有高分辨率、高通量、易用性及对于样品的小量需求等优点,但目前尚文献提出无针对DNA测序仪应用性能的系统评价指标和评价方法,本项目组经过长期的实验积累和文献查询总结了以上评价仪器应用性能的指标,并提出了相应的检测方法,以期为DNA测序仪的研发及生产提供参考。

[1]郑秀芬.法医DNA分析[M].中国人民公安大学出版社,2002(11).

[2]布尔特尔(John M.Butler).法医DNA分型专论:方法学(原书第3版)[Advanced Topics in Forensic DNA Typing:Methodology(3rd)][M].科学出版社,2013(3):31.

[3]赵颖.DNA分析仪性能评价方法研究[C].公安部第一研究所论文集,2010.

[4]荣海博.DNA测序仪分辨力测试方法研究[C].公安部第一研究所论文集,2010.