关于核糖体DNA序列分析在昆虫系统学中的作用浅析

葛振萍

(沈阳职业技术学院 辽宁沈阳 110045)

序列是生物信息学中的数学模型的一种,占有基础性的地位,用于组织存储核酸分子和蛋白质分子的一级结构。在生物研究领域,序列分析是重要的研究内容,通过对生物序列的分析,可以对生物研究对象的功能与结构关联的有效信息进行研究。在昆虫系统学中,一直一类一直采用传统分类学对昆虫的形态进行具体的分类,但是传统分类学在属和种,特别是近缘种的分类中具有一定的局限性。随着生物技术的不断发展和进步,分子生物学技术在昆虫系统学中逐渐加以应用,其中以核酸序列分析中的核糖体DNA应用最为广泛,有效的弥补了传统分类学的缺陷。核糖体DNA序列分析与传统分类学相结合,在昆虫系统学研究中发挥了重要的作用。

1 核糖体DNA结构

生物分类中应用DNA序列分析的方法是建立在生物进化理论和遗传理论的基础之上的。自然界中的生物在不断地进化后,种类十分丰富而且具有一定的秩序性。祖种经历了漫长的升级和进化在不同的地域,不同的环境条件下进行分化,形成了现今复杂的自然生物系统。核酸是生物之间的遗传物质,带有遗传基因,虽然经历了漫长的进化和变异的过程后,但是仍然带有物种进化历史的信息和痕迹,因此通过对核酸序列的分析必然会探知不同生物物种之间的血缘关系,为昆虫系统的分类提供可靠的依据。

核糖体DNA,简称rDNA,是编码核糖体RNA的基因,在专司蛋白质合成的细胞器中广泛的分布,包括RNA和大亚基、小亚基组成,其中RNA占60%的比重,而大小亚基又是由蛋白质组成的。细胞质rDNA又可分为四种,前三种为28S rRNA(4 718 bp)、5.8S rRNA(160 bp)、5S rRNA(120 bp),在大亚基中存在,另外一种为18S rRNA(1 874 bp),在小亚基中存在。细胞质核糖体18S、5.8S、28S、rDNA重复单位如下图1所示。

图1 细胞质核糖体18S、5.8S、28S、rDNA重复单位

细胞质核糖体rDNA具有总体进化速度不高、保守性的特点,在昆虫系统学中适合在较高级阶元的分类中应用较为适合。18S、5.8S、28S rDNA三者间具有不同的保守性,因此在系统发育研究方面也分别适用于不同的阶元。在间隔区也有不同程度的多变区存在,通过对多变区的合理利用,能够对采取形态学方法区分困难的属和种进行区别。5S、5.8S rDNA因为序列较短,能够提供的系统发育信息量很有限,很少在昆虫系统学的研究中加以应用。

2 rDNA序列在昆虫系统学研究中的应用

2.1 rRNA基因编码区

在昆虫系统学中,因为分类学意义的不同序列应用的范围也有所差异。5S、5.8S rDNA在不同的染色体转录单元中存在,但是它们的碱基对都仅有100多个,序列都很短,因此进化呈缓慢状态,在昆虫中仅能够提供少量的系统发育信息,在昆成系统发育研究应用很少。18 rDNA存在于编码细胞质核糖体小亚基中,对于蛋白质的合成发挥着非常重要的作用,与5S、5.8SrDNA相比较,18rDNA高度保守,在科级以上阶元之间存在一定的差异。而且该序列长度适中,不仅为昆成系统学研究提供有效的系统发育信息,而且在实验室操作方面也比较容易。同时在该序列两段还有高度保守区,还便于设计通用引物进行序列扩增,因此应用广泛。28S rDNA存在于编码细胞质核糖体大亚基中,相对应其他序列而言,该基因的序列长度是最长的,在进化过程中该序列具有重要的生物学功能因此也比较保守,但是其具有较大变异性,在序列中包括12个高变区,在解决从种到科级水平上的系统发育关系中发挥重要的作用。在昆成系统学中,该序列在蜚蠊目、膜翅目、双翅目等类群中应用最为广泛。16S、12SrDNA存在于线粒体DNA环状分子中,主要应用在属和种之间的系统发育关系研究中,二者相较而言16SrDNA应用范围更广泛一些类群既涉及到全变态的膜翅目、鳞翅目等,同时也涉及到不全变态的同翅目及、半翅目等。

2.2 内转录间隔区

内转录间隔区,以下简称ITS,被5.8 S rDNA分成ITSI、ITS2两段,转录产物对核糖体的形成不发挥作用,这样选择压力不大,自然进化速度快,多应用于属间、种间的系统发育及种群分化方面的研究。其中的ITS2序列因为保守性高,两段序列非常保守,便于设计引物进行PCR扩增,在从形态上极其相似但生理生化方面有差异的复合体的研究方面尤其适宜。从目前应用情况来看,ITS1和ITS2在研究近缘种的鉴定方面应用比较广泛,二者之间以ITS2应用更多。

2.3 基因间隔区

基因间隔区,以下简称IGS,在昆虫系统学研究中所应用的主要是与18S、28S rDNA在染色体上处于同一转录单元的IGS,它由NTS、ETS2、ETS1组成,含有rRNA的转录启动子和促进转录的增强子,属于高度变化区。从应用中来看,IGS在研究种及以下水平相互关系中较为适用。对于IGS的NTS区,其变化度最高,对其多态性的分析多采用间接地方法,用以对近缘种进行鉴别和研究。IGS序列相较于其它序列要长得多,对其全程测序是很困难的,这也在一定程度上阻碍了该序列在研究中的应用。

3 rDNA序列分析方法

3.1 标本处理

在昆虫系统学中,昆虫核酸的提取质量非常重要,直接影响核糖体DNA的序列的获得荷分析,进而影响研究结果的准确性,而昆虫的标本处理是提取昆虫核酸最基本的步骤。实验室常用的昆虫标本处理标本主要有乙醇固定、烘干、阴干、冷冻等方法。其中乙醇固定要求采用比例为70%、95%或者无水乙醇进行固定;烘干法要求烘箱温度为50～60℃,烘干时间为24小时;阴干法是在自然条件状态下阴干;冷冻法要求在冰箱温度在零下80℃的条件下。通过研究对比发现,采用无水乙醇固定以及冷冻方法处理的标本提取DNA的质量为最优。而阴干处理方法对环境湿度要求较高,如果湿度不当回导致标本霉变,DNA降解直接影响分析结果。

3.2 总DNA的提取

生物技术的不断发展进步,新方法的不断研发,昆虫总DNA的提取操作越发简单化、多样化发展。即使采用的是同样的DNA提取方法,不同的操作者在试剂的浓度、试剂的种类方面也会有所差别。研究人员可以根据实际的需要选择适合的提取方法,配置适宜ide试剂浓度来提取昆虫总DNA。

3.3 rDNA目的片段PCR扩增及测序

rDNA不仅具有多变区,同时还具有保守区,这是rDNA能够用于对不同亲缘关系的物种进行分类和鉴别的主要依据。通常在rDNA中变坏最为突出的部分为NTS,而ITS由ITS1和ITS2组成,也存在较大的变异,因此NTS和ITS均不适宜进行引物设计。rDNA中的5.8S、18S、和28S具有高度的保守型,有利于通用引物的设计,可在PCR扩增中加以利用。

3.4 rDNA序列分析方法

对提取的rDNA序列进行分析可以得到DNA碱基组成、密码子的偏向、内部重复序列等多方面与系统发育相关的信息。通常参照国际公认的核苷酸数据库对DNA序列信息进行相似性的比较,并通过软件如Clustal W 1.8、DNAStar7.1等软件进行DNA序列分析。在rDNA系统的基础上建立系统发生树,用以将物种的进化关系采用树的形式来加以描述,这也使分析研究的结果更加准确、直观的展现出来。系统发生树目前常采用邻接法、最大简约法、最小进化法等方法来进行构建。

4 结语

随着生物学技术的发展,在核糖体DNA序列的分析方面,无论从DNA的提取技术、测序以及分析的技术方法上都有了长足的进步,已经逐步发展成熟,不仅可以应用到昆虫中甘、科等高级阶元的分类,而且可以应用到属、种,甚至种下水平相互关系的研究。同时根据序列的保守性和变化性来建立不同阶元的分子鉴定标准,对疑难综合那个的分类和地位的确定具有重要的作用。

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