酞酸酯DMP、DEP和DBP对明亮发光杆菌的毒性研究

李海燕，王平，刘雯，王心春，尉腾达

南京林业大学生物与环境学院，江苏 南京 210037

酞酸酯DMP、DEP和DBP对明亮发光杆菌的毒性研究

李海燕，王平*，刘雯，王心春，尉腾达

南京林业大学生物与环境学院，江苏 南京 210037

酞酸酯（PAEs, phthalate acid esters）是目前最普遍的有机污染物之一，一定剂量的酞酸酯会产生生殖和发育毒性等健康危害。以明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum T3）为受试生物，评价了甲醇和3种PAEs [dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate (DEP), dibutyl phthalate (DBP)]对其剂量—效应关系，以期为酞酸酯暴露风险评价提供一定理论依据。结果表明，采用Logit和Weibull非线性函数（全浓度区间）分别对甲醇和3种PAEs的浓度—效应曲线进行拟合，效果均优于线性函数（局部浓度区间）拟合。其中，甲醇的线性与Logit函数拟合r2分别为0.9592和0.9863，两者EC50分别为1.185和1.044 mol·L-1，结果相近。数据结果表明，采用明亮发光杆菌测试PAEs急性毒性时，以甲醇为助溶剂（浓度<0.247 mol·L-1，毒性效应可忽略）是可行的。在一定浓度范围内，首次以甲醇为助溶剂，以DMP、DEP和DBP 3种PAEs对明亮发光杆菌进行毒性测试。线性拟合DMP、DEP和DBP对明亮发光杆菌的浓度-效应曲线，拟合r2分别为0.9262、0.9214、0.9339，其EC50分别为2.64E-04、2.79E-04和1.14E-05 mol·L-1。与此同时，3组PAEs毒性数据均能以Weibull函数进行非线性拟合，r2分别为0.9749、0.9742和0.9648，效果良好，其EC50分别为1.49E-04、2.72E-04和9.00E-06 mol·L-1。两种拟合结果表明，Weibull函数非线性拟合效果更优，半致死浓度 EC50结果相近。由上述结果可知，以甲醇为助溶剂时，DMP、DEP和 DBP分别在6.14E-9～6.14E-3、5.04E-5～2.52E-3和3.76E-9～3.76E-5 mol·L-1浓度范围内，3种PAEs对明亮发光杆菌的急性毒性强弱为DBP>DMP>DEP。在上述浓度范围内，DMP、DEP和DBP对明亮发光杆菌的抑制率分别为96.87%、95.24%和88.35%。关键词：酞酸酯（PAEs）；DMP；DEP；DBP；明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）

酞酸酯（邻苯二甲酸酯类化合物，PAEs）是重要的工业产品（陈波和林建国，2009），被广泛用于塑制品、化妆品、涂料等生产领域。范德华力与氢键力使酞酸酯易于向外界环境迁移扩散，从而成为最普遍的有机污染物之一。大量实验与统计表明，一定剂量PAEs会产生生殖和发育毒性等健康危害（McKee等，2006；Grande等，2007；Boberg等，2011；Guerra等，2010；Bradlee等，2003；Hines等，2011；黄昕和厉曙光，2004；Guo等，2011；Heudorf等，2007；Herr等，2009；Irvin等，2010）。目前已有部分PAEs被相关机构确定为环境优先控制污染物。然而，国内外关于酞酸酯的暴露剂量—效应关系研究基本处于空白状态，目前已建立关于酞酸酯剂量—效应关系曲线的准确报道很少（Wang等，2015）。

发光细菌是生物毒理学领域重要的研究受试生物之一，已被广泛用于重金属、农药等物质的急性毒性测定和研究（韦东普等，2008；Su等，2012；Zou等，2012）。本研究以明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum T3）为受试生物，测定分析邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）和邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的毒性效应。由于上述3种PAEs溶解度较小，实验中以甲醇为助溶剂，在研究其对明亮发光杆菌的毒性影响基础上，进一步研究其为助溶剂状态下3种PAEs对明亮发光杆菌的毒性效应，以期为酞酸酯毒性研究及暴露风险评价提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

仪器：DXY-3型生物毒性测试仪，购自南京中科院跨克科技有限责任公司；海门其林贝尔VORTEX-5涡旋混合器，购自上海精密科学仪器有限公司。

试剂：甲醇（AR），氯化钠（AR），两者均购自南京化学试剂有限公司，邻苯二甲酸二甲酯（DMP，AR），邻苯二甲酸二乙酯（DEP，AR），邻苯二甲酸二丁酯（DBP，AR），3种PAEs均购自上海凌风化学试剂有限公司。

1.2 检测生物

明亮发光杆菌 T3小种（Photobacterium phosphoreum T3）冻干粉，购自中国科学院南京土壤研究所。T3小种冻干粉，安剖瓶包装，每瓶0.5 g，在2～5 ℃冰箱内保存，有效期为6个月。使用前采用2.5%氯化钠溶液进行复苏，复苏菌液置于装有冰块的保温瓶中备用。

1.3 毒性检测方法

甲醇的毒性检测方法：用去离子水将甲醇稀释成一系列浓度溶液，按照GB/T 15441—1995进行测定。

PAEs毒性检测方法：采用甲醇作为助溶剂配制DMP、DEP及DBP的储备液，使得三者储备液浓度分别为0.0614、0.0504、0.000376 mol·L-1。再用去离子水将各PAEs储备液稀释成系列浓度，按照GB/T 15441—1995进行测定。

1.4 数据处理

对明亮发光杆菌T3小种浓度-效应数据，利用orgin8.5软件，采用Logit和Weibull函数进行非线性拟合（李晓磊等，2013；葛会林等，2006；邓辅财等，2007；王成林等，2012）。选取均方根误差较小及相关系数较大的函数作为最佳拟合函数。

2 结果

2.1 明亮发光杆菌活性检测

将HgCl2与其对应平均相对发光度进行一元一次线性回归，得到一元一次线性相关方程为T=-506.53 C+104.7，r2=0.9929，对相关系数r2开根号，得r=0.9964，查得P=0.01显著水平下的临界值r（9）=0.735，则该回归方程线性关系在统计学上拟合效果显著。将 T=50代入方程，求得 HgCl2对明亮发光杆菌的EC50值为0.1080 mg·L-1。根据检测方法，当HgCl2的EC50值在（0.10±0.02）mg·L-1时，则认为发光细菌活性正常。

2.2 甲醇对明亮发光杆菌的单一毒性效应

甲醇对明亮发光杆菌的毒性影响结果见表 1。由表1可知，在甲醇浓度为0.00247～24719 mol·L-1，抑制时间为15 min时，线性拟合回归方程相关系数为0.9592，效果良好，其EC50值为1.185 mol·L-1。而甲醇对明亮发光杆菌的抑制曲线及剂量—效应关系曲线分别见图1和图2。

图1 不同稀释倍数下甲醇对明亮发光杆菌的抑制率Fig. 1 Inhibition ratio of methanol to Photobacterium phosphoreum T3 at different dilution multiples

图2 甲醇对明亮发光杆菌的浓度-效应曲线Fig. 2 Dose-response curve of methanol to Photobacterium phosphoreum T3

表1 甲醇及3种PAEs对明亮发光杆菌的毒性效应线性拟合Table 1 Linear fitting of toxicity effects of methanol and the three PAEs on Photobacterium phosphoreum T3

2.3 PAEs对明亮发光杆菌的毒性效应

以甲醇为助溶剂，分别测试明亮发光杆菌对不同浓度DMP、DEP、DBP 3种酞酸酯的致毒效应，得到DMP、DEP和DBP对明亮发光杆菌的浓度-效应曲线，分别见图3、图4和图5。在一定浓度范围内，将3种PAEs对明亮发光杆菌浓度效应曲线进行线性拟合，结果见表1。

图3 DMP对明亮发光杆菌的浓度-效应曲线Fig. 3 Dose-response curve of DMP to Photobacterium phosphoreum T3

图4 DEP对明亮发光杆菌的浓度-效应曲线Fig. 4 Dose-response curve of DEP to Photobacterium phosphoreum T3

图5 DBP对明亮发光杆菌的浓度-效应曲线Fig. 5 Dose-response curve of DBP to Photobacterium phosphoreum T3

3 讨论

3.1 甲醇对明亮发光杆菌的单一毒性效应

图1显示，当纯甲醇稀释倍数<5时，甲醇溶液对明亮发光杆菌有完全致死效应。稀释倍数在5～100区间时，对稀释倍数和抑制率进行线性拟合，得到表1中所拟合的方程。以y=50代入该方程，得到甲醇EC50对应稀释倍数为32倍，对应甲醇的EC50=37.82 mg·mL-1，这与贾继民等（2012）研究的结果相近。当稀释倍数大于100时，甲醇溶液对明亮发光杆菌的抑制率基本平缓，且接近于零，此时微量的甲醇对明亮发光杆菌的毒性效应基本可以忽略。在常温下PAEs溶解度很小，待测溶液配制过程中，稀释倍数远大于 100（甲醇浓度<0.247 mol·L-1），采用明亮发光杆菌测试PAEs急性毒性时，以甲醇为助溶剂是可行的。

以往研究绝大多数均使用线性拟合或对数函数拟合，但当有毒物质对生物体剂量达到足够大时，生物体应该区域平缓的“死亡期”，即剂量效应曲线趋于“平台”（李兴春等，2011），所以对于整个剂量区间仅采用线性拟合是不准确的。采用Logit模型公式（1）对甲醇剂量-效应曲线进行拟合（图2），可以有效解决该问题。

其中，相关系数 r2=0.9863，拟合效果良好，拟合结果得到明亮发光杆菌半致死效应EC50=1.044 mol·L-1，即33.408 mg·mL-1，与前述线性拟合结果相近。

3.2 PAEs对明亮发光杆菌的毒性效应

表1显示，3种PAEs的拟合曲线相关系数在0.9214～0.9339之间，DMP、DEP、DBP分别对应的EC50值为2.64E-04、2.79E-04和1.14E-05 mol·L-1。该数据显示3种PAEs对明亮发光杆菌的致毒效应大小顺序为：DBP>DMP>DEP。

以甲醇为助溶剂，DMP、DEP和DBP对明亮发光杆菌的浓度-效应曲线显示，3种PAEs对发光细菌的致毒效应均随着浓度增加而愈发明显。3种效应曲线均为采用Weibull非线性函数公式（2）进行拟合所得，其相关系数分别为 0.9749、0.9742和0.9648，显示拟合效果优于线性拟合中的相关系数，其他相关参数见表2。

DMP、DEP和DBP 3种PAEs对明亮发光杆菌的半致死效应浓度 EC50值分别为 1.49E-04、2.72E-04和9.00E-06 mol·L-1。该数据显示，水体中3种PAEs对明亮发光杆菌的致毒效应大小顺序为：DBP>DMP>DEP。

表2 3种PAEs对明亮发光杆菌毒性效应的Weibull函数拟合Table 2 Weibull fitting of toxicity effects of the three PAEs on Photobacterium phosphoreum T3

与线性拟合结果相比，以Weibull非线性函数拟合所得DMP和DEP的EC50值均在同一个数量级，后者DMP的EC50值稍小，DEP的EC50值几乎相等。两种拟合条件下DBP的EC50的值虽然相差一个数量级，但是数值是相近的。上述结果表明，对3种PAEs的两种拟合结果是相符的。

图3、图4和图5显示，3种PAEs最大抑制率的对应浓度基本接近相应的溶解度。DMP、DEP、DBP 3种PAEs的浓度区间依次为6.14E-9～6.14E-3、5.04E-5～2.52E-3和3.76E-9～3.76E-5 mol·L-1。其中，DMP与DBP的浓度区间跨越范围较宽，而DEP的浓度区间只有两个数量级，表明明亮发光杆菌对DMP和DBP更敏感，水体中含有极微量的DMP和DBP都会对发光细菌造成威胁。而DEP对明亮发光杆菌的致毒效应相对弱一些，尽管如此，水体中微量的DEP也会对发光细菌产生致毒作用。与此同时，DBP与DMP在达到相同致毒效应时，所需浓度更低，也即 DBP对发光细菌的致毒性更强，这可能与相对分子量较大相关。

将PAEs与甲醇对明亮发光杆菌的浓度-效应曲线进行对比，甲醇对发光细菌的浓度-效应曲线与Logit函数的拟合效果更佳，而PAEs的致毒效应曲线更适合Weibull函数。甲醇的致毒浓度区间在一个数量级以内，故而适合于 Logit函数。而 PAEs的浓度-效应曲线致毒浓度区间跨越数量级范围较大，曲线相对平缓，适合于Weibull函数。其中差别可能是由这些有机物的分子量决定的。

图3、图4、图5显示，DMP、DEP和DBP对明亮发光杆菌的最大抑制率分别为 96.87%、95.24%和88.35%。DMP与DEP的最大抑制率基本接近100%，可视为达到完全致毒效应。而DBP并没有达到完全致毒效应，高浓度区抑制率也没有出现平缓趋势。这可能是受到常温下水体中 DBP溶解度制约的结果。

4 结论

在常温下PAEs溶解度很小，采用明亮发光杆菌测试PAEs急性毒性时，在一定条件下微量的甲醇对明亮发光杆菌的毒性效应基本可以忽略，以甲醇为助溶剂是可行的。在一定浓度区间内对甲醇的急性毒性效应曲线进行线性拟合，其EC50为37.82 mg·mL-1，在全区间内进行Logit拟合，其EC50为1.044 mol·L-1，即33.408 mg·mL-1，两者拟合结果相符。以甲醇为助溶剂，在一定范围内，线性拟合DMP、DEP和DBP对明亮发光杆菌的浓度-效应曲线，分别对应的 EC50值为 2.64E-04、2.79E-04和1.14E-05 mol·L-1。而在全浓度区间范围内采用Weibull非线性函数拟合，分别对应的 EC50值为1.49E-04、2.72E-04和9.00E-06 mol·L-1，两者结果相近，3种 PAEs致毒效应大小顺序为DBP>DMP>DEP。

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Study on Toxicity of Phthalate Acid Esters (PAEs) to Photobacterium phosphoreum

LI Haiyan, WANG Ping*, LIU Wen, WANG Xinchun, WEI Tengda
College of Biology and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

Phthalate acid esters (PAEs) are one of the most common organic pollutants currently. A dose of PAEs would bring about health hazards such as reproductive and developmental toxicity. To provide some academic evidence of exposure and risk assessment to PAEs, the dose-response of methanol and the three PAEs (DMP, DEP and DBP) to Photobacterium phosphereum T3 was evaluated. The results showed that, the dose-response of methanol and the three PAEs could be separately better non-linear fitted by Logit and Weibull equations (in full concentration range) compared to linear fitting (part of the concentrations). For methanol, the correlation coefficients R2of linear fitting and non-linear fitting were 0.9592 and 0.9863 separately. And their EC50calculated by both ways were similar with results of 1.185 and 1.044 mol·L-1. The data results showed that it was feasible for methanol (with concentration of < 0.247 mol·L-1) to act as co-solvents for the three PAEs (DMP, DEP and DBP) in acute toxicity test. The toxicity assessment of the three PAEs to Photobacterium phosphoreum T3 was performed in certain doses. Linear fitting was executed for the dose-response curves of DMP, DEP and DBP. Their EC50values were 2.64E-04, 2.79E-04 and 1.14E-05 mol·L-1, while the three correlation coefficients r2were 0.9262, 0.9214 and 0.9339, respectively. In the meantime all the data could be well non-linear fitted by Weibull equation (in full concentration range). Their correlation coefficients R2were 0.9749, 0.9742 and 0.9648 respectively. The results were satisfied and their EC50values were 1.49E-04, 2.72E-04 and 9.00E-06 mol·L-1. The both fitted data expressed that the Weibull non-linear was more fitted and their EC50values were similar. By the results, for DMP, DEP and DBP with respective concentration ranges of 6.14E-9～6.14E-3, 5.04E-5～2.52E-3 and 3.76E-9～3.76E-5 mol·L-1, the acute toxicity to Photobacterium phosphoreum T3 was DBP > DMP > DEP. In the concentration ranges, the inhibiton ratios for DMP, DEP and DBP were 96.87%, 95.24% and 88.35% respectively.

phthalate acid esters; dimethyl phthalate; diethyl phthalate; dibutyl phthalate; Photobacterium phosphoreum

X503

A

1674-5906（2015）01-0121-05

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.01.018

李海燕，王平，刘雯，王心春，尉腾达. 酞酸酯DMP、DEP和DBP对明亮发光杆菌的毒性研究[J]. 生态环境学报, 2015, 24(1): 121-125.

LI Haiyan, WANG Ping, LIU Wen, WANG Xinchun, WEI Tengda. Study on Toxicity of Phthalate Acid Esters (PAEs) to Photobacterium phosphoreum [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(1): 121-125.

国家自然科学基金面上项目（31270680）；江苏高校优势学科（环境科学与工程）建设工程资助项目

李海燕（1988年生），女，硕士，主要研究领域水污染控制。E-mail: lihaiyan25204@126.com *通信作者：王平（1962年生），女，教授，博士，江苏省“六大高峰人才”入选者。从事酞酸酯健康毒理学的研究。E-mail: wp_lh@aliyun.com

2014-03-02