紫色土丘陵坡地土壤微生物群落的季节变化

杨宁，杨满元，雷玉兰，赵林峰，陈孙华，付美云，林仲桂

湖南环境生物职业技术学院园林学院，湖南 衡阳421005

紫色土丘陵坡地土壤微生物群落的季节变化

杨宁，杨满元，雷玉兰，赵林峰，陈孙华，付美云，林仲桂

湖南环境生物职业技术学院园林学院，湖南 衡阳421005

采用稀释平板法和Biolog-ECO微平板技术，以剌槐（Robinia pseudoacacia）天然次生林为研究对象，研究湖南省衡阳市紫色土丘陵坡地表层（0～10 cm）土壤微生物群落的季节变化特征。结果表明：1）夏季，土壤微生物总数，细菌数量、真菌数量和放线菌数量最高，分别为 16.34×106、16.09×106、10.43×104和 14.64×104cfu·g-1干土，春季次之：11.61×106、11.45×106、5.00×104和10.65×104cfu·g-1干土，秋季最低：5.87×106、5.78×106、4.67×104和4.08×104cfu·g-1干土，春、夏和秋3季的差异达显著水平（P<0.05）；2）在培养168 h时，土壤微生物C源平均颜色变化率（Average well color development，AWCD）以夏季最高（1.20），春季次之（0.88），秋季最低（0.83）；3）土壤微生物功能多样性表现为夏季明显高于春、秋2季（P<0.05），夏季的Patrick丰富度指数（R）（28）、Shannon-Wiener指数（H）（3.22）、Simpson指数（D）（0.96）和McIntosh指数（U）（8.20）显著高于春、秋2季（P<0.05），而春、秋2季的R（23，24）、H（3.06，3.08）、D（0.95，0.95）和U（5.90，5.91）无显著差异（P>0.05）；4）氨基酸类、聚合物类和羧酸C源类是衡阳紫色土丘陵坡地土壤微生物偏好且利用率较高的C源类型；5）主成分分析表明，土壤微生物群落的C源利用可分为2类，一类在夏季，另一类在春、秋2季，其得分系数的分布范围分别为（2.59～6.00，2.43～5.09）和（-7.65～-1.90，-6.38～-3.43）。研究结果为科学评价湖南省衡阳市紫色土丘陵坡地土壤生境质量退化和恢复过程中微生物特征的变化提供了本底值参考。

土壤微生物群落；C源利用率；群落多样性；季节变化；Biolog-ECO；紫色土；湖南省衡阳市

土壤微生物参与了土壤中发生的重要过程，如土壤结构的形成、有机质的转化及C、N、P、S的循环，在维持土壤功能方面至关重要（于青等，2008；孔滨等，2009）。土壤微生物也是维持土壤质量的重要因素，微生物学指标能敏感地反映土壤质量的变化，是土壤质量评价指标体系中不可缺少的组成部分（杨宁等，2013c，2014a，2014b）。土壤微生物群落功能多样性（Biolog）是描述土壤微生物群落状态与功能的指标，可以反映土壤中微生物的生态特征（郑华等，2004；杨满元等，2013）。土壤微生物群落结构和底物利用能力的变化主要受自然环境温度、湿度以及植物残体等周而复始的季节波动的影响（Schutter等，2001；Spedding等，2004；胡婵娟等，2011）。已有研究表明，土壤微生物群落结构与活力因季节更替引起的变化，要比因养分施用和土地利用方式引起的变化大得多（Bardgett等，1999；Bossio等，1998）。

湖南省衡阳市紫色土丘陵坡地面积 1.625×105hm2，是湖南省生态环境最为恶劣的地区之一，也是中国南方极具代表性的生态灾难易发地区，由于紫色土极易水蚀，发育期短，地力差，常处于幼年阶段，加上颜色深、吸热性强，夏季地面温度极高（据记载，极端最高温度可高达 75.2 ℃），蒸发量大，生态环境具有先天的脆弱性，加之区域性水、热分布等不利环境影响和不合理的开发，致使该区域长期以来不仅植被稀疏，而且水土流失和季节性旱灾严重（杨宁等，2013a，2013b）。为了防止该区域土地质量的退化，实现该区域土地资源的可持续利用，许多学者围绕土壤生境质量开展了大量的研究，但在结果分析时均采用撂荒地或休闲地作为对照（杨宁等，2012；陈璟和杨宁，2012，2013a，2013c）。正是由于撂荒地或休闲地都经历了不同程度的人为干扰，致使研究结果有对比分析针对性不强。为此本文以典型的湖南省衡阳市紫色土丘陵坡地的土壤为研究对象，研究土壤微生物种群数量及其功能多样性的季节性变化特征，目的在于探明研究区域退化生态系统恢复机理，为构建该区域生态系统恢复技术体系提供理论依据。

1 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

湖南省衡阳市紫色土丘陵坡地（110°32′16″～113°16′32″ E，26°07′05″～27°28′24″ N）地处湖南省中南部，湘江中游，东起衡东县霞流镇、大浦镇，西至祁东县过水坪镇，北至衡阳县演陂镇、渣江镇，南达常宁市官岭镇、东山瑶族乡和耒阳市遥田镇、市炉镇一带，其中以衡南、衡阳两县面积最大，地貌类型以丘岗为主，紫色土呈网状集中分布于该区域中部海拔60～200 m的地带。该区域属亚热带季风湿润气候，年均温18 ℃，极端最高气温40.5 ℃，极端最低气温-7.9 ℃，年平均降雨量1325 mm，年平均蒸发量1426.5 mm，平均相对湿度80%，全年无霜期286 d。

1.2 研究方法

1.2.1 土壤样品的采集与制备

研究地点位于湖南省衡南县谭子山镇内（112°36′～112°48′ E，26°39′～26°58′ N），区域内以紫色土为主，属典型的紫色土区域。2012年4月25日（春季）、8月16日（夏季）和10月26日（秋季），在谭子山镇的工联村的剌槐（Robinia pseudoacacia）天然次生林中设置20 m×20 m的临时标准地1块，样地海拔为125 m，坡位：中、下坡，坡度：25°，坡向：SW，土层厚度：90 cm，腐质层厚度：10 cm，主要林下植被为牡荆（Vitex negundo var. cannabifolia)；糯米条（Abelia chinensis）和6月雪（Serissa japonica）等，盖度：65%。采用“Z”型5点取样法，分别选取3个试验点，采集表层（0～10 cm）新鲜土样并充分混匀，带回实验室，并将土壤样品分为2份，1份过2 mm筛后保存于4 ℃的冰箱，用于培养微生物的分离、计数及土壤微生物群落功能多样性的测定；另1份风干过筛用于土壤理化性质的测定。试验地的土壤理化性质见表1。

表1 试验地的土壤理化性质Table 1 Soil physio-chemical properties in the sampling plots

1.2.2 土壤样品的测定

土壤含水量（Soil water content，SWC）：铝盒烘干法（105 ℃，12 h）；有机质（Soil organic matter，SOM）：K2Cr2O7-浓硫酸外加热法；全氮（Total nitrogen，TN）：半微量凯氏法；全磷（Total phosphorus，TP）：NaOH熔融-钼锑抗显色-紫外分光光度法；碱解氮（Alkali-hydrolyzed nitrogen，AN）：扩散吸收法；速效磷（Available phosphorus，AP）：NaHCO3提取-钼锑抗显色-紫外分光光度法；速效钾（Available potassium，AK）：NH4Ac浸提-原子吸收法；pH值：电极电位法（鲍士旦，2000）。

采用稀释涂抹平板计数法测定和计算可培养微生物的数量（细菌用牛肉膏蛋白胨培养培养基；真菌用马丁氏培养基；放线菌用改良高氏1号培养基）（吴金水等，2006）。

采用 Biolog-ECO板技术分析微生物群落代谢特征，即功能多样性（Garland和Mills，1991；Zak等，1994；杨宁等，2009；邵元元等，2011）。具体操作如下：

1）称取相当于10 g的烘干土壤的新鲜土(除去杂草和石子等杂物)加入盛有90 mL灭菌的生理盐水（0.85%）于250 mL的三角瓶中，用封口膜封好，在摇床上250 r·min-1振荡30 min；

2）取5 mL上清液加入到45 mL灭菌的生理盐水中，重复以上步骤，将溶液稀释1000倍；

3）最后用 8通道移液器将上述稀释液加入Biolog-ECO微平板（BIOLOG，Hayward，USA）的96个孔中，每孔150 μL。将接种好的Biolog-ECO微平板于28 ℃条件下培养，分别于24、48、72、86、120、144、168、192、216、240 h在微孔板读数仪（BIOLOG Inc，USA）上读取750和590 nm的吸光值。

1.2.3 数据的统计分析

单孔的平均颜色变化率（Average well color development，AWCD）可以评判微生物群落对C源利用总的能力（Garland和Mills，1991；Zak等，1994）。

其中：Ci为所测定的31个碳源孔的吸光值，R为对照孔吸光值。土壤微生物群落多样性指数分析采用Patrick丰富度指数（Patrick Richness Index，R）、Shannon-Wiener指数（Shannon-Wiener Index，H）、Simpson指数（Simpson Index，D）和McIntosh指数（McIntosh index，U）表示（Magurran，1988；杨宁等，2011，2013c；李红和杨宁，2014）。采用SPSS 13.0软件进行方差分析（ANOVA）、最小显著差异分析（LSD）和主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），所有数据均为3次重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 可培养微生物类群及数量的变化

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，其群落的组成或活性对土壤肥力的保持具有重要意义。土壤微生物（主要包括细菌、真菌和放线菌 3大类）数量和比例可以反映微生物群落大小和结构特征，与土壤肥力、土壤健康状况密切相关（Li等，2013；林先贵和胡君利，2008；杨宁等，2014c）。

研究表明（表2），衡阳紫色土丘陵坡地春、夏和秋季土壤微生物总数的大小顺序为夏季（16.36×106cfu·g-1干土)>春季（16.36×106cfu·g-1干土）>秋季（16.36×106cfu·g-1干土）（P<0.05），同样，细菌、真菌和放线菌的数量也均以夏季最高、春季次之、秋季最低，其差异达显著水平（P<0.05），细菌的变化范围为（5.78～16.09）×106cfu·g-1干土、真菌：(4.67～10.43)×104cfu·g-1干土，放线菌：（4.08～14.64）×104cfu·g-1干土。土壤微生物数量的多少与植物生长状况、SOM的供应以及温湿等环境有关（高雪峰，2007；陈璟和杨宁，2013b），夏季气温高，雨水多，植物生长旺盛，SOM最高，所以夏季土壤微生物数量最高。

表2 不同季节土壤微生物的数量与组成Table 2 Quantity and composition of soil microbe in different seasons cfu·g-1干土

3个季节土壤微生物以细菌为主，占微生物总数的98.46%～98.62%，其百分比的大小顺序为春季（98.62%）>夏季（98.47%）>秋季（98.46%）（P>0.05）；真菌：0.43%～0.80%，秋季（0.80%）>夏季（0.64%）>春季（0.43%）（P<0.05）；放线菌：0.70%～0.92%，秋季百分比（0.70%）显著低于春季、夏季的百分比（0.92%和0.90%）（P<0.05），此研究结果说明在土壤微生物类群中，细菌为绝对优势类群，与刘军等（2013）的研究结果相似。

2.2 土壤微生物群落碳源平均颜色变化率

平均颜色变化率（Average well color development，AWCD）代表土壤微生物的总体活性，其值可以评判土壤中微生物群落的C源利用能力，在一定的程度上反映了土壤中微生物种群的数量和结构特征（Choi和Dobbs，1999；胡君利等，2007）。培养开始后，每隔24 h测定AWCD，得到AWCD随时间的动态变化图（图1）。由图1可知，不同季节土壤微生物 AWCD的总体变化规律一致，24 h内，各季节AWCD值很小且无明显变化，表明C源基本未被利用，24～168 h，AWCD急速升高，微生物处于指数生长期，C源开始被微生物大量利用，168 h后，AWCD持续平缓升高至试验结束。ECO培养下，不同季节AWCD随时间的变化呈“S”形曲线，符合微生物利用基质一般生长曲线规律，即存在较明显适应期、对数期和稳定期等阶段（沈萍，2000）。

随着培养时间的延长，随着时间的延长，不同季节AWCD的增加幅度不同。其中，夏季在整个培养过程中水平最高，增加幅度最大，增长斜率达0.6065；春季次之，增长斜率为0.4583；秋季在在整个培养过程中始终维持较低水平，且增加幅度最小，斜率仅为0.4167。鉴于168 h时，春、夏和秋季土壤AWCD值分别为0.88、1.20和0.83，可以认为衡阳紫色土丘陵坡地在夏季 C源的消耗量最大、速率最高，土壤微生物的代谢最快、活性最强。春季次之，秋季最低。主要原因：夏季温度最高，降雨量最多，使植物生长旺盛，植物根系残体和分泌物都很多，导致进入土壤中的新鲜有机物质增加，丰富了微生物所需要的营养物质的来源，大大刺激了土壤微生物的生长和繁殖，进而代谢活性显著提高；在秋季，土壤水分含量有所降低，随着植物的继续生长，根系从土壤中吸收大量养分，进而减少对土壤微生物养分的供应，一方面使微生物的繁殖受到一定的影响，另一方面使微生物的代谢活性有所降低（隋跃宇等，2006；孟庆杰等，2008）。

2.3 土壤微生物群落功能多样性的变化

土壤微生物多样性能敏感地反映生态系统的功能演变及环境的变化，可指标微生物种类和功能的变异（Kozdroy和Van Elsas，2000；周宝利等，2010）。不同功能多样性指数反映了土壤微生物群落多样性的不同侧面。Patrick丰富度指数（R）表示被利用的 C源的总数目；Shannon-Wiener指数（H）反映土壤微生物的丰富度和均匀度，受样本总数、拟种数和均匀度的影响；Simpson指数（D）用于评价系统中最常见的物种优势度；McIntosh指数（U）和均匀度是基于群落物种多维空间上Euclidian距离多样性的指数和均匀度，是群落物种均一性的度量，物种数（能源利用的C源数）越多且某些物种优势明显（即C源利用强度大），在C源利用种类数相同的情况下，群落的McIntosh值越大，则C源的利用程度越大（Atlas，1984；Rutgers等，1998）。

图1 不同季节微生物群落平均颜色变化率(AWCD)随培养时间的变化Fig. 1 Average well color development(AWCD) in different seasons with culture time

从表3可以看出，夏季的Patrick丰富度指数（R）（28）、Shannon-Wiener指数（H）（3.22）、Simpson指数（D）（0.96）和McIntosh指数（U）（8.20）显著高于春、秋2季（P<0.05），而春、秋2季R（23，24）、H（3.06，3.08）、D（0.95，0.95）和U（5.90，5.91）无显著差异（P>0.05）。其中：夏季的R分别是春、秋2季的1.22和1.17倍；H：1.05和1.04倍；D：1.01和1.01倍；U：1.39和1.38倍。说明在衡阳紫色土丘陵坡地，由于不同生长季节生态环境的差异，导致土壤微生物群落多样性和结构的不同（陈璟和杨宁，2013d）。

表3 不同季节土壤微生物群落多样性指数动态变化Table 3 Changes of the microbial functional diversity indices in different seasons

2.4 土壤微生物群落对C源利用率的变化

土壤微生物多样性反映了群落总体的变化，但未能反映微生物群落代谢的详细信息（杨永华等，2000；刘作云和杨宁，2014；杨宁等，2014c）。研究土壤微生物对不同C源利用能力的差异，有助于更全面微生物群落代谢功能的特征。

表4 不同季节土壤微生物群落对C源的利用Table 4 C source utilization by soil microbial communities in different seasons

研究表明（表4），衡阳紫色土丘陵坡地土壤微生物对糖类、羧酸类和胺/氨类利用范围分别为（0.64～1.18）、（0.80～1.21）和（0.72～1.09）、其中夏季最高，显著高于春秋2季（P<0.05），春季次之，秋季最低，但春、秋2季差异不明显（P>0.05），糖类、羧酸类和胺/氨类春、秋2季的利用率分别只有夏季的55.08%和54.24%、67.77%和66.12%、68.81%和66.06%；氨基酸类：（1.05～1.38），其利用率的大小顺序为：夏季（1.38）>秋季（1.19）>春季（1.05）（P<0.05），春、秋2季的利用率分别是夏季的76.09%和86.23%；聚合物类：（0.95～1.23），夏季（1.23）>秋季（1.18）>春季（0.95）（P<0.05），春、秋2季的利用率分别为夏季的95.93%和77.24%；酚酸类：（0.35～0.79），春季利用率显著低于夏、秋 2季（P<0.05），分别为夏、秋2季的44.31%和47.30%。这些研究结果充分说明在夏季土壤微生物群落的C源利用能力最高。鉴于土壤微生物对氨基酸类、聚合物类和羧酸类C源的利用率在不同的季节中均维持相对较高的水平，可以初步确定在衡阳紫色土丘陵坡地不同季节土壤微生物比较偏好且利用率较高的C源类型为氨基酸类、聚合物类和羧酸类。

由于Biolog-ECO微平板每组对31种C源的测定结果形成了描述微生物群落代谢特征的多元向量，不易直观比较，因此，应用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）比较不同季节土壤微生物群落对微平板上的31种C源的总体利用情况。主成分个数的提取原则是相应特征值大于1的前m个主成分。据此原则共提取8个主成分，累计贡献率达87.86%，其中PC1为36.78%，权重最大、PC2次之，16.25%，PC3～PC8较小，分别为 8.00%、7.04%、6.21%、5.43%、4.26%、3.89%，因此本文只对PC1、PC2进行分析（图2）。分析表明，不同季节在PC轴上出现明显的差异，春、秋2季均出现在PC1、PC2的负端，因此，可将春、秋2季土壤微生物群落的 C源利用情况归为一类，春季（PC1，PC2）3次重复得分系数分别为（-5.09，-5.54）、（-3.64，-6.38）和（-2.87，-3.43），秋季（PC1，PC2）3次重复得分系数分别为（-7.65，-4.44）、（-4.32，-5.12）和（-1.90，-3.65），春、秋2季得分系数的分布范围为（-7.65～-1.90，-6.38～-3.43）；夏季则出现在PC1、PC2的正端，可将夏季土壤微生物群落的C源利用情况归为另一类，夏季（PC1，PC2）3次重复得分系数分别为（2.59，4.67）、（3.06，5.09）和（6.00，2.43），夏季得分系数的分布范围为（2.59～6.00，2.43～5.09）。

图2 不同季节土壤微生物C源利用特征的主成分分析(PCA)Fig. 2 Principal component analysis(PCA) of C utilization by soil microbial community in different seasons

3 结论

（1）湖南省衡阳市紫色土丘陵坡地土壤微生物数量以夏季最高、春季次之、秋季最低，其差异达显著水平（P<0.05），其中，夏季土壤微生物总数，细菌数量、真菌数量和放线菌数量分别为：16.34×106、16.09×106、10.43×104和14.64×104cfu·g-1干土；春季：11.61×106、11.45×106、5.00×104和10.65×104cfu·g-1干土；秋季：5.87×106、5.78×106、4.67×104和4.08×104cfu·g-1干土；

（2）土壤微生物整体活性以夏季最高，达1.20，春季次之，为0.88，秋季最低，只为0.83；

（3）土壤微生物功能多样性表现为夏季明显高于春、秋2季，夏季的Patrick丰富度指数（R）（28）、Shannon-Wiener指数（H）（3.22）、Simpson指数（D）（0.96）和McIntosh指数（U）（8.20）显著高于春、秋两季（P<0.05），而春、秋2季R（23，24）、H（3.06，3.08）、D（0.95，0.95）和U（5.90，5.91）无显著差异（P>0.05）；

（4）土壤微生物群落的C源利用能力表现为夏季高于春、秋2季，衡阳紫色土丘陵坡地土壤微生物比较偏好且利用率较高的C源类型为氨基酸类、聚合物类和羧酸类；

（5）主成分分析表明，土壤微生物群落的C源利用可分为2类：一类为夏季，另一类为春、秋2季，其得分系数的分布范围分别为（2.59～6.00，2.43～5.09）和（-7.65～-1.90，-6.38～-3.43）。

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Seasonal Variations of Soil Microbial Communities on Sloping-Land with Purple Soils

YANG Ning, YANG Manyuan, LEI Yulan, ZHAO Linfeng, CHEN Sunhua, FU Meiyun, LIN Zhonggui
College of Landscape Architecture, Hunan Environmental-Biological Polytechnic College, Hengyang 421005, China

Seasonal variations of soil microbial communities in surface soil(0～10 cm) of Robinia pseudoacacia natural secondary forest on sloping-land with purple soils in Hengyang city of Hunan province, south-central China was studied by using the method of dilution-plate method and Biolog ECO-microplate culture. The results showed that: (1)The quantity of soil microorganism, bacteria, fungi and actiomycetes was the maximum in summer, they was 16.34×106, 16.09×106, 10.43×104and 14.64×104cfu·g-1dry soil, respectively, fewer in spring, 11.61×106, 11.45×106, 5.00×104and 10.65×104cfu·g-1dry soil, respectively, the minimum in autumn, 5.87×106, 5.78×106, 4.67×104and 4.08×104cfu·g-1dry soil, respectively, there existed significantly difference among the microbe quantity of three seasons(P<0.05); (2)The peak value of AWCD(Average well color development) was found in summer(1.20), followed by spring(0.88) and autumn(0.83) in consequence; (3)The microbial functional diversity was significantly higher in summer than in spring and autumn(P<0.05), and showed no significant difference in spring and autumn(P>0.05), for summer, Patrick richness index(R)(28), Shannon-Wiener index(H)(3.22), Simpson index(D)(0.96) and McIntosh index(U)(8.20), for spring and autumn, R(23, 24), H(3.06, 3.08), D(0.95, 0.95) and U(5.90, 5.91); (4)Amino acids, ployers and carboxylic acids were the main C sources utilized by the microbial communities; (4)PCA(Principal component analysis) showed the C sources by soil microbes were divided into two categories, one in summer, another, spring and autumn, the range of score coefficient were (2.59 _ 6.00, 2.43 _ 5.09) and (-7.65 _ -1.90, -6.38 _ -3.43), respectively. Above all, this result would provide more important primitive properties of microbial features in the degradation and restoration process of the quality of the soil habitat scientifically on the sloping-land with purple soils in Hengyang of Hunan Province, South-central China.

soil microbial community; C source utilization; community diversity; seasonal variation; Biolog-ECO; purple soils; Hengyang city of Hunan province, south-central China

S154.3

A

1674-5906（2015）01-0034-07

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.01.006

杨宁，杨满元，雷玉兰，赵林峰，陈孙华，付美云，林仲桂. 紫色土丘陵坡地土壤微生物群落的季节变化[J]. 生态环境学报, 2015, 24(1): 34-40.

YANG Ning, YANG Manyuan, LEI Yulan, ZHAO Linfeng, CHEN Sunhua, FU Meiyun, LIN Zhonggui. Seasonal Variations of Soil Microbial Communities on Sloping-Land with Purple Soils [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(1): 34-40.

湖南省科技厅项目（S2006N332）；湖南省教育厅科学研究项目（12C1057）；湖南省林业科技创新计划项目（XLK201341）；湖南省衡阳市科技计划项目（2014KN27）；湖南省普通高校青年骨干教师培养对象资助项目

杨宁（1974年生），男（苗族），副教授，博士，主要从事植物生态学与恢复生态学的教学与研究。E-mail: yangning8787@sina.com

2014-09-29