采用不同ELISA试剂盒对猪瘟抗体水平调查结果的影响

蔺 露 董春霞 孙 燕 徐 璐 王 琴

(1.重庆市动物疫病预防控制中心,重庆 401120；2.中国兽医药监察所,北京 100081)

采用不同ELISA试剂盒对猪瘟抗体水平调查结果的影响

蔺 露1董春霞1孙 燕1徐 璐2王 琴2

(1.重庆市动物疫病预防控制中心,重庆 401120；2.中国兽医药监察所,北京 100081)

本文采用猪瘟抗体间接ELISA和阻断ELISA检测试剂盒对320份血清样本进行猪瘟抗体检测，符合率达80.63%，对检测结果不一致的样品，利用抗体中和试验（FVNT）做定性检测，结果表明，间接ELISA试剂盒的敏感性和特异性均高于阻断ELISA试剂盒，猪瘟间接ELISA试剂盒更适用于我国猪瘟抗体检测。

猪瘟 抗体中和试验 酶联免疫吸附法

猪瘟又称经典猪瘟（Classical Swine Fever，CSF），是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一类高度接触性传染病，是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一[1]。国际兽医局（OIE）将其列为必须上报的传染病。20世纪50年代，中国兽医药品监察所的周泰冲研究员等开发了猪瘟兔化弱毒疫苗株，该疫苗免疫原性好，安全性高，包括中国在内的世界各国采用该疫苗成功的控制了猪瘟大范围流行[2]。我国目前对猪瘟的防控采取疫苗全群免疫策略，因此，猪瘟抗体水平监测就成为评价疫苗免疫效果的主要手段。目前我国用于猪瘟抗体水平检测的主要有抗体中和试验、酶联免疫吸附法（ELISA）和正向间接血凝方法等。而国际上推荐的方法主要为抗体中和试验和ELISA方法[3]。本研究对采集的320份血清样本用两种不同的ELISA试剂盒进行检测，然后对两种试剂盒检测结果有差异的血清用抗体中和试验进行定性检测，比较两种试剂盒的检测结果，为最终筛选适合我国田间大范围推广应用的试剂盒提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）猪瘟病毒Thiveral株、猪瘟病毒荧光抗体、PK15传代细胞系：由中国兽医药品监察所鉴定，保存并提供。

（2）猪瘟病毒间接E L ISA抗体检测试剂盒（简称“I-ELISA”）：由中国兽医药品监察所提供，批号为20121115。

（3）猪瘟抗体检测试剂盒（简称“B-ELISA”）：购自美国IDEXX公司。

（4）血清：采自重庆市境内5个区县的规模场、种猪场及散养户，共计320头份。其中，免疫血清250头份，非免疫仔猪血清70头份。

1.2 方法

1.2.1 ELISA试剂盒检测 将上述320头份血清用I-ELISA和B-ELISA试剂盒进行同步检测，每份血清检测2个重复。操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 抗体中和试验检测 本研究中采用猪瘟病毒的单克隆荧光抗体进行中和试验（Fluorescent antibody virus neutralization test，FVNT）。

2 结果

2.1 临床血清样本的I-ELISA和B-ELISA检测结果及比较（见表1）

表1 两种试剂盒对临床血清的检测结果

2.2 不同ELISA试剂盒对不同免疫背景血清的检测结果（见表2）

表2 两种试剂盒对不同背景血清的检测结果统计表

2.3 FVNT对两种试剂盒检测结果

不一致的有62份（除1份血清的余量不足外）均进行了FVNT检测，结果见表3和表4。

表3 I-ELISA与FVNT的检测结果统计表

表4 I-ELISA与FVNT的检测结果统计表

3 讨论

3.1 猪瘟抗体检测方法的选择

在进行猪瘟抗体检测时，OIE推荐的方法为抗体中和试验和ELISA方法。抗体中和试验根据抗体标记物的不同又可分为过氧化物酶中和试验（Neutralising peroxidase-linked assay，NPLA）和荧光抗体病毒中和试验（Fluorescent antibody virus neutralization test，FVNT）。抗体中和试验的原理是将待检血清与一定量的猪瘟病毒混合孵育后接种敏感细胞，根据病毒对细胞的感染情况对待检血清抗体效价进行测定。该方法主要检测中和抗体，但操作复杂，耗时长（大于3d），且实验条件要求高，检测通量小，并不适合在基层使用。而临床上常见的是采用ELISA血清学的检测方法对猪瘟抗体进行检测。

3.2 不同种类ELISA试剂盒的选择

检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒中，主要分为两类：间接ELISA和阻断ELISA。间接ELISA是将纯化的猪瘟病毒结构蛋白包被在反应板中，加入待检血清后，血清中的特异性抗体会与包被抗原发生结合，通过辣根过氧化物酶标记的二抗进行显色，反应孔的颜色反应强度与特异性抗体的量成正比。阻断ELISA也是包被猪瘟病毒结构蛋白，加入待检血清后，阳性抗体会与包被蛋白上的特定表位结合并封闭，使之后加入的酶标单抗无法结合到该表位上，从而起到了阻断作用，反应孔的颜色反应强度与特异性抗体含量成反比[4]。本研究中选择的猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒（即I-ELISA）采用的是间接ELISA 原理，而进口的猪瘟抗体检测试剂盒（即“B-ELISA”）采用的是阻断ELISA原理，通过对这两种试剂盒的检测效果进行比较，结果证明，在对田间样本进行检测时，猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的敏感性和特异性均高于猪瘟抗体检测试剂盒。

3.3 不同免疫猪群的免疫效果存在差异

对不同地区、不同来源的猪血清样本进行分析发现，I-ELISA检测种猪场免疫血清的阳性率最高，分别为100%和97.5%，而规模化猪场的阳性率在不同地区呈现不同的水平；B-ELISA检测种猪场免疫血清的阳性率偏低，分别为70%和92.5%，而规模化猪场的阳性率也有很大差异。通过两种试剂盒的检测结果发现，不同地区的猪群免疫水平存在差异，而且选择不同试剂盒对抗体水平检测结果也有很大影响。将检测结果存在差异的血清进行FVNT定性检测后发现，I-ELISA与FVNT的符合率为70.49%，远远高出B-ELISA。其他研究也证明[5]，I-ELISA试剂盒的准确性更高。

[1] 殷震.动物病毒学[M].中国农业大学出版社，1996.

[2] 涂长春.猪瘟国际流行态势、我国现状及防制对策[J].中国农业科学，2003，36（8）：955-960.

[3] 世界动物卫生组织.陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）[M].农业部畜牧兽医局/中国动物卫生与流行病学中心，2004.

[4] John R. Crowther，the ELISA guide book[M].2001，Humana Press.

[5] 徐璐，范学政，徐和敏，等.猪瘟抗体间接ELISA检测试剂盒的研制和应用[J].中国兽医杂志，2012，48（9）：21-24.

蔺露（1983-），女，兽医师，硕士，主要从事动物疫病实验室诊断及研究。

蔺露