猪感染肺炎支原体模型的建立及评估

代长云吴建英阮 征胡修忠周 华

刘开武2张四化2夏 瑜1华 娟1李 杰1黄海军1,2 ＊

(1.武汉市畜牧兽医科学研究所,湖北武汉 430208；2.武汉市畜牧兽医局,湖北武汉 430023)

猪感染肺炎支原体模型的建立及评估

代长云1,2吴建英2阮 征2胡修忠1周 华1

刘开武2张四化2夏 瑜1华 娟1李 杰1黄海军1,2 ＊

(1.武汉市畜牧兽医科学研究所,湖北武汉 430208；2.武汉市畜牧兽医局,湖北武汉 430023)

为了建立猪肺炎支原体感染的动物模型，选取实验室培养保存的猪肺炎支原体济南株F66株（编号：CVCC354），在不同时间点对12头实验猪进行人工感染，分别建立早期、中期和晚期猪支原体肺炎动物模型。采用PCR、形态学、组织学等多种方法对模型进行评估，证实早期、中期和晚期猪支原体肺炎动物模型成功建立。

猪 肺炎支原体 动物模型

猪支原体肺炎（Mycop lasma pneumonia of swine）亦称猪喘气病或猪流行性肺炎，是由猪肺炎支原体（M ycop lasm a hyopneumonia，MhP）引起的一种慢性呼吸道传染病。此病具有高发病率、低死亡率、流行范围广的特点，严重影响猪的生长率和饲料转化率，是造成养猪业经济损失的重要疾病之一。

MhP是猪呼吸道疾病中最常见的分离病原之一，主要危害除降低日增重和提高料肉比之外，最重要的是它能破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障，从而引起多病原的继发感染和混合感染，引发猪支原体肺炎。为了更直观有效地研究该病的临床治疗方法，我们模拟临床发病过程，复制了肺炎支原体感染的动物模型，为下一步临床治疗研究提供合适的实验材料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

PPLO肉汤培养基、酵母粉由BD公司生产，马血清、MEM培养基由Gibco公司生产，葡萄糖、琼脂粉、精氨酸、青霉素、1%酚红均购自武汉众一生物科技有限公司。

1.2 菌种

菌种及菌液制备；猪肺炎支原体（Mhp）济南株F66株（编号：CVCC354）由中国兽药监察所提供。开封后以PPLO培养基原量稀释、培养、传代并测其颜色变化单位（ccu/ m l），置-20℃保存，3 d 内使用。用前稀释至104～ 5ccu/ml。

1.3 PPLO培养基配制

葡萄糖2.5g，PPLO 10.5g，酵母粉2.5g，琼脂粉7.5g（液体培养基中不加），超纯水定容至445m l，116℃灭菌20min后，加入马血清50m l，无菌10%精氨酸5ml，灭菌10×MEM 5ml，无菌8万单位/m l青霉素溶液5m l，无菌1%酚红溶液500μL（固体培养基中不加）。

1.4 Mhp的培养及Mhp菌数的测定（CCU 实验）

取无菌 PPLO 培养基 100 ml，按 5∶1 比例加入小牛血清 20 m l 混匀，分装到无菌锥形瓶中，60m l/瓶。培养基中加入 100μl菌液（4℃保存）。盖硬胶塞后用封口膜封口，静置培养在 37℃恒温箱中。每日观察其颜色变化。我们采用颜色改变单位测定法计算Mhp 的菌数，具体如下：

取 11 支无菌小试管，按①～⑩编号，取 1.8 m l已添加小牛血清的PPLO培养基溶液（5∶1 比例）分别加入试管中。取 200μl已传代培养 7d的处于对数生长期的菌种加入①号试管中，依次1∶10 递减稀释，即①号为Mhp原液，②号管为 10-1，③号管为10-2，依次类推，⑩号管为 10-9，第 11 号试管作为阴性对照管不加Mhp菌液。将各组试管加盖硬胶塞并用封口膜封口后，静置于37℃恒温箱中培养，每日观察颜色变化以及液体有无浑浊改变。发生颜色改变的最高稀释度为颜色改变单位。

1.5 试验动物

12头健康杜洛克长白杂交猪，公母兼有，购自武汉市畜牧兽医科学研究所试验猪场。在猪场实验猪舍观察两周，无咳嗽、气喘等症状后进入试验环节。随机分为4组，试验1组（早期）3头（24.4±1.6kg），试验2组（中期）3头（24.2±1.7kg），试验3组（晚期）3头（24.6±1.4kg），对照组3头（24.5±1.2kg）。饲养管理按照《武汉市畜牧兽医科学研究所试验猪场饲养管理规定》进行。

1.6 动物感染 MhP

1.6.1 接种批次与剂量

试验组（早、中、晚期）每头动物第 0 天接种含 1×107ccu/ ml的MhP液各10ml；对照组动物第 0 天接种无菌 0.9%生理盐水各10m l。

1.6.2 接种方法

用加样器吸入处于对数生长期的Mhp 菌液，缓滴入试验猪鼻腔使其进入气管支气管[5]。

1.7 动物模型的评估

1.7.1 样品收集

试验1组（早期）、试验2组（中期）、试验3组（晚期）分别于接种后12d、16d、21d后采集样品。收集鼻腔及咽喉处分泌物，放入加有1 m l 生理盐水的灭菌试管中。

1.7.2 模型建立标准

（1）外观表现观察

接种后，每间隔6h 观察1 次，分别记录试验猪和对照猪的精神状态及临床表现。每天记录日增重、体温。

（2）剖检及组织病理切片检测

剖检时主要观察肺部、淋巴等组织器官病变情况。按常规程序制备肺脏和淋巴组织切片，行HE染色，在显微镜下观察病变情况。

（3）PCR检测

将收集的样品高速离心，弃上清后加入20μl STET 细胞裂解液，煮沸10 m in，离心后取上清用于PCR 检测。PCR反应体系25μl：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP（2.5mM/L）2μl，阳性引物5’-ACACCATGGGAGCTGGTAA-3’和5’-CATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3’（10μl/L）各0.5μl，阳性模板1μl，Taq DNA polymerase（2.5U/μl）0.25μl，加ddH2O至25μl。同时设立ddH2O阴性对照。反应条件为：94℃5min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃ 10min。PCR反应结束后，取1μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察记录结果。

2 结果与分析

2.1 MhP的培养

MhP在含有 20%胎牛血清的 PPLO 培养基中生长时能够分解葡萄糖产酸但不产气，使培养液的 pH 值降低，酚红指示剂由红色变为橘黄色，随着MhP的生长，pH 值进一步降低，黄色逐渐加深，到 3 周末时已全部变成黄色。

于 37℃恒温箱内静置培养 1 个月后，各试管中培养液颜色改变在⑧号管（10-7）处停止，表明其 CCU 值为 107，即被测菌液稀释到 10-7仍有MhP生长，每支试管中液体均无沉淀浑浊。

2.2 感染猪外观表现

感染猪表现明显的精神沉郁，靠墙角呆立或卧倒，活动减少，被毛粗糙，肺部出现明显的肺湿呼吸音（图1a）。感染12 d以后模型组各种症状逐渐加重（图1b），尤其是鼻部出现脓性分泌物，个别者带有少量血丝，呼吸时可听到鼻塞声和喘鸣声。体重下降，体温升高。

图1 感染猪精神沉郁、呆立或卧倒

2.3 组织病理变化

剖检显示对照组3头猪的肺组织及其他脏器无明显炎症反应。试验组肺组织、淋巴组织多呈中度或重度炎症改变（图 2），肺部病变明显，外观充血、水肿，严重者肺叶分布散在大小不等的坏死灶。其中试验1组有2头猪肝脏呈轻度炎症改变，试验1组有2头猪的肾脏呈轻度炎症改变。

组织切片结果显示了早期、中期、晚期3组试验猪的肺脏、淋巴等病理变化特征，与其对应分为轻度感染、中度感染、重度感染3个过程，具体如下：

轻度（早期）：病变范围比较局限，肺泡间隔轻度增宽，间隔内有少量淋巴细胞浸润，细支气管上皮排列尚规则，管腔的周围有少量炎症细胞浸润。

中度（中期）：病变范围比较广泛，肺泡间隔增宽较明显，间隔内有较多淋巴细胞浸润，肺泡结构部分破坏，细支气管上皮增生、破坏，小血管周围淋巴细胞浸润。

重度（晚期）：病变范围广泛，肺泡间隔明显增宽，间隔内有大量淋巴细胞浸润，细支气管上皮破坏、脱落，管腔内有明显渗出，肺间质毛细血管、支气管旁小静脉瘀血。

图2 感染猪肺脏、淋巴病变

图3 猪肺脏、淋巴病理切片

2.4 PCR检测结果

PCR检测结果表明，收集的试验组9头猪样品中均检测到猪肺炎支原体阳性，且在一定程度上感染时间延长呈阳性增强趋势，对照组3头猪均为阴性（图4）。证实猪肺炎支原体模型构建成功。

图4 PCR检测结果

3 讨论

猪支原体肺炎对各种猪均易感，在新引进猪群多呈急性暴发，其发病率和死亡率常在20%以上，最急性型的死亡率可高达80%～100%。本病发病率高，流行快，除引起死亡外还导致病猪长时间带菌，大量消耗机体组织，严重影响猪的生产性能和商品性能，大大增加养殖成本。而且，支原体可通过空气传播，很难隔离阻断传播途径，极易引起全群发病，是公认的最难净化的猪病，给养殖业带来巨大损失。本病在我国的流行十分广泛，呈逐年上升趋势，已成为危害养猪业最严重的疾病之一，给我国养猪业造成严重的经济损失。

目前，已有多种动物成功建立了支原体肺炎的模型，但是对猪支原体肺炎模型的建立及相关研究非常有限。本研究建立猪肺炎支原体感染模型，旨在为有针对性地治疗猪支原体肺炎疾病提供理想的动物模型。

本研究中采用的 PPLO 培养基成分和常用于 MhP 分离培养的Hayflick 培养基基本相同。此外 SP-4 培养基、马丁氏肉汤培养基等也用于 MhP 分离培养，其基础培养基成分基本相同[10]。MhP的培养要求比普通细菌高，除了一般基础营养物质外，还需添加10%～20%的动物血清提供胆固醇、脂肪酸和蛋白质及 10%的新鲜酵母浸液以提供核苷酸前体、维生素及刺激生长因子等。接种前应将培养基的 pH 值调至 7.8，因 MhP 生长的最佳 pH 值范围是7.6～7.8。MhP 分解葡萄糖产酸后使培养基的 pH 值下降，故添加 0.002%的酚红可作为观察培养基颜色变化的指示剂。MhP 在固体或液体培养基中生长繁殖达高峰后，若继续培养则由于培养基pH 值的变化而很快死亡。虽然有资料显示死的 MhP 也能引起实验动物肺部炎症改变，但却不如活菌明显，因此本研究使用的是107ccu/ml 的MhP 菌液，以保证其中 MhP 的活力。

本实验接种结果显示，试验组接种后第5d即出现了精神状态略差，进食及活动减少等表现，以后逐渐恢复，第10d鼻部出现分泌物，伴随气喘、竖毛、寒战等症状。在感染晚期，口、鼻分泌物较前明显增多，提示其气道反应性增加。实验组动物肺组织病理切片提示不同程度的炎症改变，如：肺泡间隔增宽，间隔内、支气管旁、血管周围以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，支气管上皮细胞增生、坏死、脱落，肺泡结构破坏等。试验1组多呈轻度改变或无炎症；试验2组动物多呈中重度改变；试验3组多呈重度改变。所有实验组动物的鼻腔分泌物的 MhP 培养均为阳性结果，对照组为阴性。综上所述：本研究成功建立猪支原体肺炎感染模型，为进一步研究 MhP 感染的发病机制和 MhP 感染后机体免疫状态及对症治疗奠定了基础。

[1] 金洪效，毛洪先.猪气喘病的诊断与防治[M].江苏科学技术出版社，1993：8-12.

[2] 祝俊杰，刘贵滨，李秀敏，等.猪喘气病综合防治技术的研究及应用[J].中国兽医杂志，1993，19（8）：10-12.

[3] 刘晓红，辛德莉，侯安存，等.小鼠肺炎支原体肺炎模型的建立及组织病理学评分方法的应用[J].重庆医学，2004，33（9）：1338-1340.

[4] 杨春，周莉，何永林.探讨接种时间和剂量对小鼠肺炎支原体肺炎模型建立的影响[J].四川动物，2009，28（4）：524-528.

国家自然科学基金（31201938）、武汉市晨光计划（201150431078）、武汉市农科院英才计划（YC201101）项目资助。

代长云，男，高级兽医师，学士，研究方向为畜牧兽医研究与技术推广。

黄海军，男，副研究员，博士，研究方向为动物生物技术与疫病防控。