重庆市常用及新选玉米自交系SSR指纹图谱构建

2015-12-05邸仕忠孙小红罗永统陈维竟彭福英彭福佳

安徽大学学报(自然科学版) 2015年5期

邸仕忠，孙小红，罗永统，陈维竟，彭福英，彭福佳，杨飞

（1.重庆市渝东南农业科学院特种作物研究所，重庆涪陵 408000；2.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆涪陵 408100）

近年来，随着国家调整玉米产业体系相关政策方针的出台，“国务院关于加快推进现代农作物种业发展的意见（2011国务院8号文件）”的实施和推进，及大量国外种业巨头进入中国，玉米育种竞争趋于白热化，各育种单位均在积极进行材料创新［1］.但我国玉米育种长期依赖于少数骨干材料，新选的自交系和杂交种同质化严重，甚至出现个别单位和个人盗取他人亲本、杂交种套牌等不良现象［2－4］.因此，在进行自交系选育的同时，利用分子标记检测其遗传多样性，构建自交系的DNA指纹图谱，不仅可以了解材料间的遗传基础、亲缘关系和杂优类群，还可以保护自交系的品种权免受侵犯［5］.SSR（simple sequence repeat）技术因其信息含量高、呈共显性、易于操作等特点，已被广泛应用于许多作物的DNA指纹图谱构建［2－4］.谭君［6］、赵久然等［7－9］分别对西南地区玉米自交系和中国玉米新品种进行了 DNA 指纹库建立，初步建立了一套适用于自交系和玉米品种鉴定的SSR标准体系，但未见重庆地区玉米自交系DNA指纹图谱方面的研究.作者利用SSR分子标记技术构建重庆市部分常用及新选育优良自交系的指纹图谱，分析其遗传多样性，为自交系的改良提供依据并为保护其知识产权奠定基础.

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用重庆市渝东南农科院新选自交系61份，各亚群代表自交系5个，自交系名称编号见表1.

表1 66个自交系名称及编号Tab.1 The materials used in study and their resource

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

采用砂培法培养玉米幼苗，每个样品取15株叶片混合后，采用2×CTAB法提取并纯化基因组 DNA［11］.

1.2.2 PCR扩增

采用10μL PCR体系，包括1×buffer，2.5μmol·L－1MgCl2、150μmol·L－1dNTPs、0.2μmol·L－1引物、1UTaq酶和100ng DNA模板.将反应液在振荡器混匀后，加入20μL液体石蜡覆盖.反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃预变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min，12℃保存.

1.2.3 电泳、银染

在扩增产物中加入2μL 3×SGB（98%去离子甲酰胺；10mM EDTA，pH 8.0；0.025%溴酚蓝；0.025%二甲苯青）.每个样取4.5μL，在1×TBE缓冲液条件下，用6%的聚丙烯酰胺变性的凝胶进行电泳，恒定功率75W预电泳约30rain，75W电泳约1h.银染参照辛景树［9］的程序进行.

1.2.4 引物的选择

结合已有的研究基础，参照北京市玉米亲本鉴定地方标准“DB11／T 507－2007”中玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法，选择40对SSR核心引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.3 数据统计分析

根据PCR扩增结果，对表现出多态性的扩增带数量化：在相同迁移位置有带记为“1”，无带记为“0”，缺失数据记为“9”，建立数据库.以简单相配系数（simple matching coefficient，简称SM）计算自交系的遗传相似值（genetic similarity，简称GS）［10］.GS＝m／（m＋n），m表示基因型共有带数目；n表示基因型间差异带数目.利用 NTSYS－pc version 2.1软件进行数据处理，按 UPGMA方法（un－weighted pair group method using arithmetic averages）对供试自交系进行聚类.每个SSR位点的多态性信息（polymorphism information contention）按Smith等［11］的公式计算，即 PIC＝1－∑fi2，其中fi表示位点的基因频率.

2 结果与分析

2.1 SSR分子标记检测结果

40对SSR核心引物中，32对PCR条带清晰、稳定性好、多态性高.以此32对引物对66个玉米自交系进行PCR扩展及检测，结果表明，在66个自交系中共检测出155个条带，每对引物检测到条带2～12个，平均为4.84个，其中多态性条带占100%.每个位点的多态性信息量（PIC值）变幅为0.516～0.988，平均为0.721，其中引物bnlg2305的PIC最大，为0.988；引物umc2007的PIC最小，为0.516.扩增条带数和PIC值结果见表2.供试自交系中遗传相似系数变化范围为0.54～0.88，平均值为0.68，多数遗传相似系数都大于0.60，遗传相似系数在0.60～0.70间分布最多，占60.33%.说明供试材料间有一定的遗传差异.

表2 32对SSR引物在66个玉米自交系中检测到的等位基因数、PIC值Tab.2 The number of alleles and PIC in the 66maize lines detected by 32pairs of SSR primer

续表2

2.2 引物的确定

评价32对引物在66份自交系间的带型清晰度、多态性高低和带型统计的难易程度，作为最终构建指纹图谱的候选引物.再根据入选引物在每条染色体上均匀分布的原则，最终确定umc2105k3、phi072k4、umc1545y2、umc1125y3、phi080k15、umc1506k12、bnlg249k2、phi299852y2、umc1936k4 和bnlg2235y5等10对引物作为供试玉米自交系指纹图谱构建的引物.10对引物对66个玉米自交系的检测结果表明，10对引物共检测出31个条带，每对引物检测到条带3～4个，平均为3.10个，其中多态性条带占100%，phi072k4条带数最多为5个，每个位点的多态性信息量（PIC值）变幅为0.487～0.723，平均为0.651，说明这套引物具有较好的鉴别能力.图1为引物umc2105不同条带的带型图.

2.3 亲本的指纹图谱及数字化

利用10对引物对66份玉米代表品种构建指纹图谱，特征条带长度在149～432bp，转化为数字指纹.66份玉米自交系间，相似系数在0.29～0.94之间，平均值为0.62.聚类分析表明，10对引物可将66份玉米自交系区分开来.根据赵久然等［8］提出假设同一引物的不同扩增带型的基因频率相同，即同一引物的不同等位基因等频率出现的条件下，如果某个引物对的等位基因数是n，则该引物理论上可区分的最大自交系数为N＝n，最大杂交种数N＝1／2n（n＋1），出现相同指纹图谱的概率P＝－I／N.该研究中确定的一套10个核心引物组合可区分的最大自交系数N＝N1×N2×…×N10＝10×6×6×6×6×6×6×6×6×6＝1.01×108，出现相同指纹图谱的概率P＝9.29×10－9.因此，可以利用这套引物构建重庆主要玉米自交系指纹.将筛选到的10对引物所扩增的片段数字化，使每一个亲本的指纹图谱都用相应的数字表示构成系谱各世代亲本的身份证号码，可以用于该自交系的真伪鉴定，结果列于表3.

表3 66份玉米自交系的数字化DNA指纹图谱Tab.3 Digitizing DNA fingerprint of 66maize lines used in this study

续表3

3 讨论

近年来，随着国家相关政策方针的出台，加之大量国外种业巨头进入中国，对玉米新品种权的保护及玉米品种的真实性和纯度鉴定要求越来越高.SSR分子标记技术在玉米品种亲缘关系和分类研究、品种的真实性和纯度鉴定、新品种指纹图谱构建、新品种的区试DUS测试、区试品种质量监控等方面得到广泛的应用，并发挥着越来越重要的作用［9］，目前已建立大量玉米自交系及杂交种的DNA指纹图谱.谭君等［6］利用20对引物构建了西南地区常用的73份玉米自交系的SSR指纹图谱.赵久然、辛景树［7－8，10］等利用SSR分子标记构建了中国部分玉米新品种DNA指纹库.李丽华等［11］利用9对SSR引物构建了四川农业大学玉米研究所20个玉米自交系的指纹图谱.王伟等［12］利用20对SSR构建了贵州省2000年以来审定的48个玉米杂交种及其亲本的指纹图谱.邱红波等［13］利用6对SSR引物构建了36份喀斯特高海拔山区玉米骨干自交系的指纹图谱.刘涛等［14］利用SSR分子标记技术研究了黔东南地方玉米品种，利用4对多态信息量高的引物建立了21个地方品种的DNA指纹图谱.盖树鹏等［15］分别利用10对和20对适于玉米自交系和杂交种分析的核心引物，构建了山东省35份骨干自交系和19份主栽杂交种的SSR指纹图谱.该文作者的试验结果表明，32对引物在66个玉米自交系中共检测出155个条带，其中多态性条带占100%，平均多态性信息量为0.721，说明供试材料间有一定的遗传差异.确定10对SSR引物作为核心引物构建了重庆66份玉米自交系的指纹图谱.这10对引物的扩增条带均为3～4条，多数为3条，带型统计简单，可区分的最大自交系数N＝1.01×108，出现相同指纹图谱的概率P＝9.29×10－9，检测66份自交系的DNA指纹图谱没有任何两份带型完全相同.证明利用这10对引物自交系的鉴定是可行有效的，可用于重庆地区玉米自交系鉴定.但筛选出的10对核心引物与谭君、李丽华、王伟、邱红波、刘涛和盖树鹏等筛选的引物均存在差异，这可能与不同地区不同的玉米材料多态性存在差异有关.而关于如何确定最佳的引物组合，至今没有统一的观点，关于重庆地区玉米材料最佳的核心引物组合有待选取更多的自交系材料进行验证，进一步筛选适合于重庆地区的最佳核心引物.

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