介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备及作为蛋白类缓释药物载体的应用

何晓梅，古莉娜

（安徽大学 化学化工学院，安徽 合肥 230601）

羟基磷灰石，又称羟磷灰石，是钙磷灰石（Ca5（PO4）3（OH））的自然矿物化.其经常被写成（Ca10（PO4）6（OH）2）的形式以突出它是由两部分组成的：羟基与磷灰石.羟基磷灰石是脊椎动物骨骼和牙齿的主要组成，人的牙釉质中羟基磷灰石的含量在96%以上.羟基磷灰石，由于其独特的性质，从普通的羟基磷灰石到纳米羟基磷灰石一直都是人们研究的热点.纳米羟基磷灰石具有溶解度高、生物相容性好、比表面积大等特点.近年来，制备纳米羟基磷灰石的方法有很多，例如：水热法［1－3］、微乳液法［4－5］、模拟体液法［6－7］、模板法［8－10］、溶胶凝胶法［11－12］、化学沉淀法［13］.其中，水热法具有制备晶粒的尺寸可控、颗粒团聚现象少或无团聚、纯度高、结晶完整等优点，是一种低能耗、低污染的方法，而且粉体质量好，产量也较高.

Ijntema等［14］最先采用共沉淀法将蛋白类药物包裹于纳米晶粒中，成功获得了具有缓释功能的药物释放体系，并进一步研究证明了该体系可有效地控制药物的释放速率.由于纳米HA与蛋白质分子之间具有极好的生物相容性和极高的亲和力，其已被广泛用于蛋白类缓释药物的缓释载体［15－18］.在药剂学领域，药物缓释系统是重要的研究方向之一；作为药物制剂的前沿领域，药物缓释系统引起了制药工业的广泛关注.

作者结合气液沉淀法和水热法，成功地合成了棒状的介孔HA纳米粒子.以牛血清白蛋白（BSA）为模式蛋白药物，考察了BSA在HA上的吸附行为以及HA－BSA复合物的体外释放行为.结果表明，介孔纳米HA可以作为蛋白药物载体且能实现药物的可控制释放.

1 试验材料和试验方法

1.1 试验材料

牛血清白蛋白（BSA，分子量67 000，等电点4.8）购于上海源聚生物科技有限公司，硝酸钙购于天津市光复精细化工研究所，无水乙醇购于上海振兴化工一厂，磷酸氢二氨购于西陇化工股份有限公司，氨水购于上海博河精细化学品有限公司.上述化学试剂均为分析纯.

1.2 羟基磷灰石的合成

称取2.951 9g四水合硝酸钙和0.990 5g磷酸氢二氨分别溶于50mL无水乙醇及50mL蒸馏水中.将盛有硝酸钙溶液的小烧杯置于装有100mL氨水的密封大烧杯中，在氨气的作用下，硝酸钙溶液的pH被调节到10.5左右.在这种碱性环境下，边搅拌边缓慢滴加磷酸氢二铵水溶液.滴加完毕后，继续搅拌2h，然后将浑浊液倒入反应釜中，120℃条件下水热24h.用超纯水和无水乙醇多次洗涤产物，60℃下干燥12h，研磨，即得样品.

1.3 羟基磷灰石纳米粒子的表征

采用X射线衍射（XRD，XD－3，CuKα＝1.541 8，北京普析通用仪器有限责任公司）、透射电镜（TEM，JEM－2100，Japan）、比表面分析（BET，ASAP 2020M＋C，U.S.A）、傅立叶红外光谱（FT－IR，NEXUS－870，U.S.A）确定 HA的结构.

1.4 蛋白吸附试验

准确称取20mg羟基磷灰石纳米粒子置于10mL不同浓度的BSA溶液中，在恒温气浴振荡器上振荡10h.高速离心（10 000rpm，18min）后，移出一定量的上清液，用紫外分光光度法（UV－Vis，UVU－4100，Japan）测定上清液中蛋白的含量（选取波长为280nm），从而确定蛋白的吸附量.

1.5 HA－BSA复合物体外释放试验

精密称取30mg羟基磷灰石纳米粒子－牛血清白蛋白复合物，置于37℃不同pH的10mL磷酸缓冲液中振荡.在设定时间下停止振荡，高速离心后取出5mL上清液，用紫外分光光度法测定其蛋白质释放量.同时，向反应容器中补充5mL新鲜的磷酸缓冲液.

2 结果与讨论

2.1 HA的表征

图1为所制备HA的X射线衍射图.

从图1可以看出，各衍射峰峰形尖锐，位置和强度均与标准PDF卡片（JCPDS 09－0432）上的HA特征衍射峰吻合，表明该法合成的HA结晶程度很好，产物纯度很高.

样品的透射电镜照片如图2所示.

由图2可见，所制得的产物为分散性良好的棒状颗粒，颗粒尺寸比较均匀，长度为100～150nm，宽度约为40nm.另外，HA颗粒上具有明显的介孔结构，介孔的孔径约为4nm.

图3为HA的氮气吸附／脱附等温曲线（a）和BJH孔径分布图（b）.

从HA的氮气吸附／脱附等温曲线中可以看出，曲线具有明显的滞后环，属于典型的IV类等温线，表明样品具有介孔结构.由孔径分布图可以看出HA中的孔主要分布在4nm左右和20～50nm之间.结合电镜照片可以判断出4nm左右的介孔属于颗粒内孔，而20～50nm左右的孔可能是颗粒间孔.根据BET计算，HA的比表面积为87.3m2·g－1，孔体积为0.338cm3·g－1.BET分析结果表明，该样品比表面积较大，具有介孔结构，因此能够用作药物载体，且药物能够进入介孔内，可以有效减少药物突释，延长释放周期.

图4是BSA、HA及HA－BSA复合物的红外光谱图.

图4中曲线a为牛血清蛋白的红外图谱，其中1 660～1 650cm－1归属于N—H特征峰，而1 670 cm－1属于特征峰；曲线b为羟基磷灰石的红外图谱，其中3 571cm－1和1 634cm－1属于OH－1特征峰，而565、603、1 039、1 099cm－1归属于PO43－特征峰；曲线c中同时出现了牛血清蛋白和羟基磷灰石的特征峰，因此可以确定牛血清蛋白确实吸附在羟基磷灰石上，形成了HA－BSA复合物.

2.2 等温吸附曲线和吸附机理

图5为BSA在HA上的等温吸附曲线，BSA在HA上的吸附量可通过吸附前后的BSA浓度变化来获得.

在图5的等温吸附线上，吸附量逐渐趋向于一个极值，说明HA和BSA之间存在着吸附平衡.300、305、310K条件下的饱和吸附量分别为120、130、140mg·g－1.其吸附量大于Nagata等［19］水热合成的HA纳米颗粒（最大比表面积为120.8m2·g－1，对BSA的最大吸附量为1mg·m－2，吸附量可换算成120.8m2·g－1）；小于Zhao等［20］合成的由纳米片（＜50nm）组成的具有立体、分层纳米结构的花瓣状微米级 HA（尺寸在1～3μm，比表面积为54.4m2·g－1，对BSA的吸附量为165mg·g－1）.

由于固体在溶液中的吸附是一个复杂的过程，受到固体与溶质、固体与溶剂、溶质与溶剂等相互作用的影响，因此固体吸附理论并不完整，固体在溶液中的吸附经常使用气体吸附模型进行表征，其中最常用的是Langmuir模型和Freundlich模型.公式（1）、（2）分别是Langmuir模型和Freundlich模型的线性表达形式.

Langmuir模型

Freundlich模型

其中：qe为 HA对BSA的平衡吸附量：μg·mg－1；ce为BSA溶液的平衡浓度：mg·mL－1；qmax为 HA对BSA的饱和吸附量：μg·mg－1；k为吸附系数；n为常数.分别用Langmuir模型和Freundlich模型对上述吸附数据进行拟合，结果如图6、7所示.由两图中的拟合结果可知，HA对BSA的吸附更符合Langmuir吸附模型，这也与吸附等温线的变化趋势一致.

2.3 HA－BSA复合物的体外释放

HA－BSA复合物在磷酸缓冲液中的体外释放曲线如图8所示.由图8可知，在中性环境条件下，初始4h内BSA释放率为10.86%，突释现象不明显；随后BSA的释放速度开始减缓，释放率随时间的延长基本呈直线增加，持续释放70h后累计释放率达78.89%.而滕利荣等［21］合成的纳米HA颗粒（宽为20～30nm，长为50～60nm）在中性环境下20min内BSA释放率达15%，持续释放200min后累计释放率达65%左右；Swain等［22］合成了3种形貌的HA颗粒（球形、棒状、纤维形，其晶粒尺寸分别为9、12、16nm，比表面积分别为256、217、47m2·g－1，对BSA的吸附量分别为26.5、28、25.7mg·g－1），在中性环境下的BSA累计释放率都在10h内突释14%左右，随后BSA的释放速度开始加快，持续释放90h后累计释放率为70%.由此可以看出，虽然该法制备的HA比表面积不是很大，但是对BSA的吸附和缓释效果都较好，有可能成为蛋白类药物的合适载体.

另外，从图8中还可以看出，BSA在pH为5.6缓冲液中的累计释放率要低于在pH为7.0缓冲液中的释放率，这一点与文献［21］中的结果一致.可能的原因是BSA与HA之间存在着电荷相斥效应.由于BSA在pH为5.6的缓冲液中所带负电荷量要低于在pH为7.0缓冲液中所带电荷量，因此在pH为5.6的缓冲液中的电荷相斥效应低于在pH为7.0缓冲液中的相斥效应，相应地，BSA在pH为5.6缓冲液中的释放率要低于在pH为7.0缓冲液中的释放率.

为了阐明HA－BSA复合物中BSA的释放机制，可以根据Korsmeyer－Peppas方程［23－25］对累积释放数据进行拟合.公式（3）即为Korsmeyer－Peppas方程，公式（4）是其线性形式.

其中：F为累计释放百分率；t为释放时间；k为释药常数，是表征释放速率大小的常数；n为释放参数，是表征释放机制的特征参数.当0.45＜n＜0.89时，药物释放机制为非Fickian扩散（即药物扩散和骨架溶蚀协同作用）；当n＜0.45时，为Fickian扩散；当n＞0.89时，为骨架溶蚀机制［26］.

图9为两种不同pH条件下BSA释放的拟合曲线，表1为拟合结果.

表1 HA－BSA复合物中药物释放过程的拟合参数Tab.1 Model parameters for the dissolution of model drug from HA－BSA

从拟合结果可以看出，拟合曲线的线性关系良好，释放参数分别为0.658（pH＝7.0）、0.633（pH＝5.6）.这说明该实验中BSA分子的释放很好地符合了非Fickian扩散.

3 结束语

作者成功地合成了介孔HA纳米颗粒，纯度高、分散性好.以BSA为模式蛋白，测定了在不同温度下的吸附等温线，310K时的饱和吸附量可达到140μg·mg－1.用不同模型对吸附等温曲线进行模拟，结果表明可以用Langmuir模型来描述HA对BSA的吸附行为.作者探索了HA－BSA复合物的体外释放行为：pH为5.6的磷酸缓冲液中的累积释放量低于pH为7.0的释放量；其释放机制为非Fickian扩散.实验结果表明，HA－BSA复合物的体外释放行为具有释放平缓，突释小，持续时间较长，累计释放率较大等特点，因此，HA纳米粒子有望作为蛋白类缓释药物的载体.

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