脑梗死大鼠缺血脑组织中Slit2蛋白的表达及与血管新生的关系

刘海燕，娄季宇，白宏英，曾志磊，闫莹莹，乐 婷

郑州大学第二附属医院神经内科郑州450014

缺血性脑血管病作为威胁人类健康的三大疾病之一，具有高发病率、高致残率和高病死率的特点，给社会和家庭带来极大负担。脑梗死后的血管新生能为组织细胞供血供氧，缩小梗死灶，减少神经缺损，并能有效帮助神经功能恢复［1］。然而，血管生成涉及多种血管生成因子、调节因子及相关的胞内通路，是一个多重交叉、辐射状联系的过程。Slit/Robo 信号通路能排斥性导向神经细胞的迁移［2］，参与环路的形成，并能减轻炎症反应，发挥神经保护作用［3］。在血管形成过程中，Slit/Robo 通路可能通过导向血管内皮顶端细胞的迁移而影响新生血管的分支和延伸。作者对缺血性卒中大鼠缺血脑组织中轴突导向因子Slit2 蛋白的表达情况进行了检测，同时检测了微血管密度(microvessel density，MVD)和Robo1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA 的表达，探讨Slit2 在血管新生过程中的作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物及试剂 成年健康雄性SD 大鼠48只，体重250～300 g，由郑州大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(豫)2010-0002。抗Slit2 兔多抗和抗Robo1 兔多抗购自Santa Cruz 公司。抗CD105 小鼠单抗购自Abcam 公司。RT-PCR 试剂盒购自Transgene 公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1．2 模型制备方法 采用改良Longa 等［4］方法建立永久性大脑中动脉梗死(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)大鼠模型。大鼠称重后用水合氯醛溶液腹腔注射完成麻醉，固定后沿颈部正中切口逐层钝性分离至颈前肌肉，在颈总动脉(CCA)搏动最清晰处剥开颈动脉鞘，分离出CCA，再依次分离出颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，夹闭ICA，再依次结扎ECA、CCA。在颈动脉分叉处下方置一手术缝线并打活结。在CCA 结扎线和活结之间剪一斜形小口，沿ICA 插入线栓，直至轻插遇阻力且标记处距分叉约2 mm 处，固定线栓至皮下后缝合。术后保暖至麻醉苏醒。术后2 h 观察大鼠神经行为学表现，并根据Longa 等［4］神经功能评分标准进行评分。评分达1～3 分且排除其他因素的动物纳入研究，剔除评分为0 和4 分者，并采用相同造模方法予以补充。

1．3 实验分组 将大鼠随机分为假手术组和模型1、3、7天组，每组12只。假手术组不结扎不插线栓，余步骤同1．2。余3组按1．2 方法造模，并分别于术后第1、3、7天处死取材，进行相关指标的检测。

1．4 标本采集和切片制作 ①新鲜脑组织标本:将大鼠深度麻醉后，置于冰块上，30 s 内断头取脑，4℃冰生理盐水冲洗后投液氮中迅速冷冻，并于－80℃冰箱中保存，用于Western blot 和RT-PCR。②石蜡包埋脑组织标本:将大鼠深度麻醉后，经心腔先后灌注生理盐水和多聚甲醛，至大鼠四肢微颤，全身僵硬，取出大脑，稍加修整后投多聚甲醛液中固定，用于免疫组化染色。切片制作:大鼠脑组织经常规固定、石蜡包埋后，于视交叉后2 mm 内进行连续冠状切片，片厚4 μm，每隔4 张取1 张切片，水洗漂片。

1．5 缺血脑组织中Slit2 蛋白的检测 采用Western blot 法检测缺血脑组织中Slit2 蛋白的表达水平。剪碎组织，加裂解液，匀浆后裂解30 min，4℃离心5 min，取上清。BCA 法检测蛋白浓度。取80 μL 样品和20 μL 5 ×SDS 上样缓冲液混匀后加热变性，灌胶上样，每孔上样量20 μL，进行SDS-PAGE。转至PVDF 膜上，用50 g/L 脱脂奶粉封闭30 min，加一抗4℃过夜，TBST 漂洗3次后加二抗，漂洗后成像扫描。以GAPDH 为内参。用Bandscan 5．0 软件进行灰度分析，以目的条带与GAPDH 条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1．6 MVD 的检测 切片脱蜡水化后，PBS 冲洗(5 min ×3次)，抗原热修复15 min，双氧水孵育20 min，加抗CD105(一抗)4℃过夜，加生物素标记的二抗室温孵育20 min，链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液室温孵育20 min。DAB 显色，苏木素复染，脱水透明，封片。用德国Leica 显微照相系统采集图像。镜下观察并参照Weidner 等［5］的方法进行微血管计数:在低倍视野下找到血管密度最高处，再在400 倍视野下，以呈棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇且与邻近的微血管或其他结缔组织分开者为一个微血管，在热点处选取4个不同区域进行微血管计数，计算MVD(单位为个/视野)。

1．7 缺血脑组织中Robo1 和VEGF mRNA 的检测 采用RT-PCR 法检测缺血脑组织中Robo1 和VEGF mRNA 的表达水平，以GAPDH 为内参。登录GenBank 获得Robo1 和VEGF 序列，设计特异性引物。Robo1 上游引物序列为5'-GGAGGAGTTCAGT GAAGAA-3'，下游引物序列为 5'-TGGTG GCATCTAGGTTTTG-3'，扩增产物长度309 bp。VEGF 上游引物序列为5'-CGGATCAAACCTCAC CAA-3'，下游引物序列为 5'-TCTCCGCTCTGAA CAAGG-3'，扩增产物长度201 bp。取约100 mg 脑组织，匀浆后加入Trizol 和氯仿提取总RNA，全程避免RNase 污染，逆转录合成cDNA，然后进行PCR 扩增。PCR 反应条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共约35个循环;72℃总延伸6 min。产物经20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像分析系统进行分析，以目的条带与GAPDH 条带灰度值的比值表示目的基因mRNA的表达水平。

1．8 统计学处理 采用SPSS 17．0 处理数据。4组大鼠Slit2 蛋白、MVD、Robo1 和VEGF mRNA 表达水平的比较采用单因素方差分析和LSD-t 检验;采用Pearson 相关分析对模型组大鼠Slit2 蛋白表达与VEGF、MVD 的相关性进行分析。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 4组大鼠缺血脑组织中Slit2 蛋白的表达 模型1、3、7天组Slit2 蛋白表达均较假手术组升高，且呈逐渐升高趋势。见图1 及表1。

图1 4组大鼠缺血脑组织中Slit2 蛋白的表达

2．2 4组大鼠缺血脑组织中MVD 的比较 模型1、3、7天组大鼠MVD 明显高于假手术组，且呈逐渐升高趋势。见表1。

2．3 4组大鼠缺血脑组织中Robo1 和VEGF mRNA 表达水平的比较 见图2、3 和表1。与假手术组比较，模型1天组Robo1 mRNA 急剧降低，模型3、7天组有所回升，但模型7天组仍低于假手术组。模型组VEGF mRNA 的表达均高于假手术组，且逐渐升高。

2．4 模型组大鼠Slit2 蛋白和血管新生的相关性分析 Pearson 相关分析结果显示，模型组大鼠Slit2蛋白表达与VEGF mRNA 表达水平及MVD 呈显著正相关(r=0．974，0．926，P＜0．001)。

图2 4组大鼠缺血脑组织中Robo1 mRNA 的表达

图3 4组大鼠大鼠缺血脑组织中VEGF mRNA 的表达

表1 4组大鼠缺血脑组织中各项指标的比较

3 讨论

Slit2 蛋白是大脑中线细胞分泌的一类可扩散性的大分子信号蛋白，具有排斥性导向神经生长锥、诱导细胞迁移、促进轴突生长和突触重塑的作用。Slit2 作为智障相关因子，在中枢神经生长发育过程中发挥重要作用，且在外周神经系统中，通过结合受体Robo1，激活下游信号分子，促进轴突再生［1-3］。Tanno 等［6］发现在坐骨神经横断术后，Slit2 mRNA表达上调并促进了损伤外周神经的修复。

与调控轴突再生类似，在调控血管生长方面，Slit/Robo 通路相关因子浓度的变化可刺激血管内皮顶端细胞，引起胞内骨架蛋白的变化，最终导致血管的延伸和分支。Wang 等［7］报道Slit2 能浓度依赖性地促进肿瘤血管的新生，从而为肿瘤的生长和转移提供血氧供应。Wang 等［8］研究也发现Slit2 高表达于口腔癌和颊囊癌肿瘤黏膜，且与肿瘤生长和MVD 相关，抗体R5 可以阻断Slit2 的这种作用。Huang 等［9］发现敲除小鼠视网膜上皮细胞Robo1 和Robo4 基因后，血管的形成和成管过程被干扰。上述研究结果均提示Slit/Robo 通路在血管新生过程中发挥重要作用。Han 等［10］成功构建了Slit2 转基因小鼠，而该小鼠大脑血管密度和渗透性均显著增加，提示干预Slit/Robo 通路有可能改善大脑循环状态。

该研究结果显示，大鼠脑梗死发生后，脑组织中Slit2 蛋白表达持续升高;Robo1 mRNA 表达先急剧降低，后逐渐升高，但在7 d 后仍低于正常水平;VEGF mRNA 表达和MVD 均逐渐升高;研究还发现Slit2 蛋白的表达与VEGF mRNA 表达水平和MVD显著正相关;提示Slit2 很可能协同VEGF 在血管新生的过程中发挥重要作用，或Slit2 蛋白通过升高VEGF mRNA 的表达来介导促血管新生作用，但具体机制仍需进一步研究。Robo1 mRNA 表达水平在梗死后早期急剧下降，考虑这与细胞受损应激和Robo1 介导的炎症细胞趋化黏附有关［11］，而随着缺血大脑炎症反应的缓和，同时受逐渐升高的Slit2 蛋白的刺激，Robo1 mRNA 表达逐渐升高，通过增加跨膜受体Robo1 来发挥Slit2 介导的促血管新生作用。

综上所述，Slit2/Robo 通路在大鼠局灶性脑梗死后血管新生中发挥了重要作用，如何通过及时增强或削减Slit/Robo 信号改善缺血病灶的微循环，还需要深入探讨。

［1］Krupinski J，Kaluza J，Kumar P，et al．Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke［J］．Stroke，1994，25(9):1794

［2］Yeh ML，Gonda Y，Mommersteeg MT，et al．Robo1 modulates proliferation and neurogenesis in the developing neocortex［J］．J Neurosci，2014，34(16):5717

［3］Altay T，Mclaughlin B，Wu JY，et al．Slit modulates cerebrovascular inflammation and mediates neuroprotection against global cerebral ischemia［J］．Exp Neurol，2007，207(2):186

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20(1):84

［5］Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al．Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma［J］．J Natl Cancer Inst，1992，84(24):1875

［6］Tanno T，Fujiwara A，Takenaka S，et al．Expression of a chemorepellent factor，Slit2，in peripheral nerve regeneration［J］．Biosci Biotechnol Biochem，2005，69(12):2431

［7］Wang B，Xiao Y，Ding BB，et al．Induction of tumor angiogenesis by Slit-Robo signaling and inhibition of cancer growth by blocking Robo activity［J］．Cancer Cell，2003，4(1):19

［8］Wang LJ，Zhao Y，Han B，et al．Targeting Slit-Roundabout signaling inhibits tumor angiogenesis in chemical-induced squamous cell carcinogenesis［J］．Cancer Sci，2008，99(3):510

［9］Huang LZ，Yu WZ，Li XX，et al．Robo1/Robo4:different expression patterns in retinal development［J］．Exp Eye Res，2009，88(3):583

［10］Han HX，Geng JG．Over-expression of Slit2 induces vessel formation and changes blood vessel permeability in mouse brain［J］．Acta Pharmacol Sin，2011，32(11):1327

［11］Gangaraju S，Sultan K，Whitehead SN，et al．Cerebral endothelial expression of Robo1 affects brain infiltration of polymorphonuclear neutrophils during mouse stroke recovery［J］．Neurobiol Dis，2013，54:24