AXL调控的MIRNA表达在NSCLC吉非替尼获得性耐药中的意义*

曹新广，吕慧芳，陈贝贝，常吉梅，唐 菲，朱彩华，樊鑫鑫，秦建军，陈小兵#

1)郑州大学附属肿瘤医院普外科;河南省肿瘤医院普外科 郑州450008 2)新乡医学院第三附属医院 新乡453003

与化疗相比，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)如吉非替尼对EGFR突变型晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的临床疗效显著［1］，但大多数患者最终会出现耐药。Axl(Anexelekto)为受体酪氨酸激酶亚家族成员之一，与生长停滞特异性基因6(growth arrest specific protein 6，Gas6)结合可激活其酪氨酸激酶活性，激活下游信号转导途径，参与细胞黏附、增殖、凋亡等过程［2］。Axl 基因异常表达在多种肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。最新研究［3］结果显示，Axl 参与调控NSCLC 吉非替尼获得性耐药，但机制仍不清楚。

miRNA 是一类长18～25 nt 的非编码单链RNA，通过与靶mRNA 的3’-UTR 端结合，抑制靶mRNA 翻译或促进其降解［4-5］。NSCLC 细胞内miRNA 表达失调与TKI 耐药和肿瘤形成关系密切［6-7］。该研究通过比较EGFR 突变型NSCLC 细胞株HCC827 及其吉非替尼耐药株HCC827-Gef 中Axl mRNA 和蛋白的表达，探讨Axl 与HCC827 细胞吉非替尼耐药的关系，再利用微阵列分析鉴定表达失调的一系列miRNA，采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)检测Axl 沉默对HCC827-Gef 细胞相关miRNA表达的影响;同时作者还对不同Axl mRNA 表达水平的NSCLC 患者相关miRNA 表达及生存状况进行比较;探讨Axl 对miRNA 的表达调控在NSCLC 吉非替尼获得性耐药中的意义。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 RPMI 1640 培养液、Trizol、NCodeTMVILOTMmiRNA cDNA 合成试剂盒和EXPRESS SYBRRGreenERTMmiRNA qRT-PCR 试剂盒购于美国Invitrogen 公司，新生胎牛血清购自Gibco 公司，吉非替尼购自Astra Zeneca 公司，GAPDH 及Axl 单抗购自Santa Cruz 公司，GeneChipRHuman Gene 2．0 ST Array 及GeneChip WT Terminal Labeling 试剂盒购自Affymetrix 公司，mirVanaTMRNA Isolation 试剂盒及WT Expression 试剂盒购自Ambion 公司。

1．2 NSCLC 细胞及新鲜组织来源

1．2．1 细胞来源 细胞EGFR 突变型NSCLC 细胞株HCC827 购自ATCC，用含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、链霉素的RPMI 1640 培养液培养。参照文献［8］构建对吉非替尼耐药的细胞HCC827-Gef。用Superfect 脂质体转染法将靶向Axl的endogenous siRNA(esiAxl)、空质粒转染HCC827-Gef 细胞，得HCC827-Gef-esiAxl 和HCC827-Gef-空质粒细胞。

1．2．2 组织来源 收集2009年10月至2010年10月在郑州大学附属肿瘤医院行肺叶切除术的肺癌患者的新鲜肺癌组织40例，置于液氮保存。患者中男22例，女18例;≤55岁15例，＞55岁25例;腺癌18例，鳞癌22例;Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期24例;吸烟32例。该研究获得郑州大学附属肿瘤医院伦理审查委员会批准。随访60个月，以复发转移或死亡为终点事件。

1．3 微阵列分析 转染48 h 后，收集HCC827-Gef-空质粒和HCC827-Gef-esiAxl 细胞，采用mirVanaTMRNA Isolation 试剂盒离子交换柱吸附法抽提总RNA(严格按照说明书操作)，应用GeneChipRHuman Gene 2．0ST Array，参照Affymetrix 基因芯片操作指南进行芯片杂交，检测对象包括广泛的编码和长链非编码RNA 转录组，联合应用GeneChip WT Terminal Labeling 试剂盒和WT Expression 试剂盒分析杂交结果中的有义链，阵列随后被染色和扫描，应用Partek Genomics Suite Software 分析数据，找出差异表达miRNA。共筛选出20个差异表达miRNA，其中miR-374a、miR-548b 敏感度最高。

1．4 NSCLC 细胞及新鲜组织中Axl mRNA 和miR-374a、miR-548b 的检测 收集待检细胞，应用qRT-PCR 法测定Axl mRNA 和miR-374a、miR-548b的表达。以HPRT1 为内参测定Axl mRNA，以U6 snRNA 作为内参测定相关miRNA。具体步骤及定量方法详见试剂盒说明书。引物参见表1。同法检测40例NSCLC 患者样本中Axl mRNA、miR-374a、miR-548b 的表达情况。

1．5 NSCLC 细胞中Axl 蛋白的Western blot 法检测 收集HCC827、HCC827-Gef 细胞，提取总蛋白，通过聚丙烯酸胺凝胶电泳分离蛋白，转移至PVDF膜上，蛋白封闭液37℃封闭1 h，PBST 洗涤，一抗(Axl 按1∶5 000 稀释)4℃振荡孵育过夜，TBST 洗涤3次，加二抗孵育1 h，TBST 洗涤3次，每次5 min。ECL 法室温显影，记录结果。以目的蛋白条带与内参条带的比值表示目的蛋白的表达水平。

表1 qRT-PCR 引物

1．6 统计学处理 应用SPSS 13．0 进行数据分析。两组间Axl mRNA 和miR-374a、miR-548b 表达的比较用两独立样本t 检验;采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线并进行Log rank 检验;检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 HCC827 和HCC827-Gef 细胞中Axl mRNA及蛋白表达的比较 HCC827-Gef 细胞中Axl mRNA及蛋白的表达均明显高于HCC827 细胞，见表2。

表2 HCC827 和HCC827-Gef 细胞中Axl mRNA 及蛋白的表达

2．2 HCC827-Gef-空质粒和HCC827-Gef-esiAxl细胞中Axl mRNA 和miR-374a、miR-548b 表达的比较 见表3。结果显示，与HCC827-Gef-空质粒细胞比较，HCC827-Gef-esiAxl 细胞中Axl mRNA、miR-374a 表达显著下降，miR-548b 表达则上调。

表3 细胞中与Axl 通路相关的miR-374a、miR-548b 的表达

2．3 NSCLC 患者Axl mRNA、miR-374a、miR-548b 表达的分析 以肿瘤组织中AXL/HPRT1 比值1 为临界值，将NSCLC 患者分为Axl mRNA 高表达(20例)和低表达(20例)组。比较2组肺组织中miR-374a、miR-548b 的表达(表4)，结果显示，Axl mRNA 高表达组miR-374a 表达高于Axl mRNA 低表达组，而miR-548b 的表达则低于Axl mRNA 低表达组。两组患者的生存曲线差异有统计学意义(图1)，Axl 低表达组患者的无病生存期延长更长(χ2=6．550，P=0．011)。

表4 Axl mRNA 高表达和低表达组NSCLC 患者肿瘤组织中miR-374a、miR-548b 表达的比较

图1 Axl mRNA 高表达和低表达组的生存曲线

3 讨论

EGFR-TKI 靶向药物如吉非替尼的发现，使EGFR 突变的NSCLC 患者生活质量明显改善，生存时间更长，但大多数患者会出现耐药，目前耐药问题仍然NSCLC 治疗中的一个主要的难题［9］，而Axl 在EGFR-TKI 获得性耐药中作用已成为目前研究的焦点。如抗肿瘤药物NPS-1034 通过激活Met 或Axl或ROS1 的重组，使对EGFR-TKI 敏感的NSCLC 患者出现获得性耐药［10］。一项研究［3］表明，EGFR 突变的肺癌细胞中Axl 表达升高，下调Axl 表达可延缓EGFR-TKI 获得性耐药的发生。此次实验中，作者观察到，耐吉非替尼肺癌细胞株HCC827-Gef 中Axl mRNA 和蛋白表达表达均高于不耐药的HCC827 细胞，提示Axl 可能参与了HCC827 细胞的吉非替尼耐药过程。

一个miRNA 可靶向上百个mRNA，调控一系列生物功能如细胞增殖、转化和凋亡，在临床诊断和预后判断中扮演重要角色［11］。该研究阐述了对EGFR-TKI 耐药的NSCLC 细胞中Axl 介导的miRNA 表达的变化，结果显示，HCC827-Gef-esiAXL 细胞Axl基因沉默后，miR-374a 表达显著下降，miR-548b 表达则上调。在对NSCLC 患者的分析结果显示，Axl mRNA 高表达组miR-374a 表达高于Axl mRNA 低表达组，而miR-548b 的表达则低于Axl mRNA 低表达组;并且Axl mRNA 高表达组患者的无病生存期较Axl 低表达组明显缩短。无病生存期缩短提示NSCLC 患者更容易对吉非替尼耐药，并容易出现复发和转移，与肺癌患者预后密切相关。

由此可见，Axl 及其调控的miR-374a 和miR-548b 在NSCLC EGFR-TKI 获得性耐药机制中发挥关键作用，它们可作为预后因子来判断NSCLC 患者预后或成为潜在的治疗靶点。

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