氟暴露儿童ERα基因甲基化水平与氟斑牙及血清钙水平的关系*

王科妍，崔蕊蕊，丁 中，崔留欣，赵明旭，程学敏，巴月#

1)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州450001 2)山东万杰医学院山东省高校生物医学工程技术实验室 淄博255213 3)开封市疾病预防控制中心地方病科 开封475000

氟斑牙作为地方性氟中毒的特征性表现之一，对儿童危害深远。以往研究［1-3］显示氟斑牙的发生除了与个体氟暴露的剂量、年龄、时间、营养因素等有关外，还存在个体易感性。雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)基因多态性与儿童氟斑牙有关;DNA 甲基化作为表观遗传特性之一目前受到广泛关注，研究［4-6］发现ERα 基因甲基化与乳癌、骨质疏松等疾病有关。但氟暴露是否引起ERα 基因甲基化改变，以及ERα 基因启动子区甲基化水平与儿童氟斑牙患病程度是否有关，目前尚未见报道。该研究通过测定氟病区儿童ERα 基因启动子区甲基化水平，分析儿童氟斑牙及血清钙水平与ERα 基因启动子区甲基化率的关系，旨在从表观遗传学角度探讨儿童氟斑牙的发病机制。

1 对象与方法

1．1 调查点的选择 在精确检测水氟含量的基础上，从河南省某县饮水型地方性氟中毒流行地区选择饮水氟质量浓度超过1．0 mg/L 的2 所小学作为调查点。2 所学校所在地区经济水平、人口分布、自然条件、农作物种类、饮食习惯、人口构成基本相同。同时测定环境介质(水、空气、土壤、农作物等)中钙水平，排除其他元素干扰。

1．2 调查对象的选择 整群抽取所选调查点8～12岁且自出生一直居住在当地的儿童(排除临床上患有影响钙磷代谢疾病和近期接受钙剂、氟化物、激素治疗的儿童)作为调查对象，共有174 名儿童入选。对符合调查要求的儿童分别进行问卷调查、氟斑牙检查、体格检查，并采集生物样本。研究经家长签署知情同意书，遵循儿童意愿，并经郑州大学伦理委员会批准。

1．3 生物样本的采集及处理 采集所有调查儿童空腹外周静脉血10 mL(非抗凝和EDTA 抗凝各5 mL)及晨尿100 mL。非抗凝血离心分离血清，并与抗凝血和尿液一起置于－80℃冰箱，保存备用。

1．4 儿童氟斑牙的判定 儿童氟斑牙检查及结果判定由地方性氟中毒防治公共卫生执业医师按照Dean 分级法［7］进行。将分级为0(正常)和1(可疑)的调查对象定义为正常组，2(极轻)和3(轻度)定义为轻度组，4(中度)和5(重度)定义为中重度组。174例儿童中，正常组85 人，轻度组53 人，中重度组36 人。

1．5 生物样本检测分析

1．5．1 儿童尿氟水平的测定 采用氟离子选择电极(PF-1 型，上海电元器件厂)法测定调查对象尿氟水平。标准曲线的线性范围为0．1～10．0 mg/L，r均＞0．999［8］。以尿氟质量浓度超过1．5 mg/L 判断为高氟负荷状态。

1．5．2 儿童血清钙水平的测定 将强酸(浓盐酸与高氯酸体积比为1∶4 的混合酸)与血清按体积比1∶100 混合、消化后，采用原子吸收分光光度计(Z-5000 型，日立，日本)以标准曲线法(r ＞0．999)进行检测，所有样品均测定2个平行样。

1．5．3 ERα 基因启动子区甲基化率检测 应用UCSC/Ensembl(http://genome．ucsc．edu/)查 找 基因启动子序列，采用甲基化引物设计软件Methyl Primer Express v1．0 设计引物序列(表1)。基因组DNA 提取采用血液基因组柱式小量提取试剂盒(北京康为世纪);采用EZ DNA Methylation-GoldTM试剂盒(Zymo Research，美国)对提取的基因组DNA 进行处理。

表1 ERα 基因启动子区甲基化引物序列及产物大小

ERα 基因启动子区甲基化率检测采用real-time PCR 方法。20 μL 反应体系中包括2 ×Ultra SYBR Green PCR Mix(北京康为世纪)10 μL，上、下游引物各160 nmol/L，300 ng DNA，6．5 μL ddH2O。PCR 反应条件:95℃10 min;94℃15 s，54℃30 s，72℃30 s，共40个循环。以纯水作为阴性对照对实验进行质量控制。参考文献［9］方法计算DNA 甲基化率。1．6 统计学处理 数据的录入采用EpiData 2．0，双人双机独立录入，分析采用SPSS 12．0。ERα 基因启动子区甲基化率数据不符合正态分布，将其对数转化后符合正态分布。3组间患儿年龄、尿氟、血清钙水平及对数转化后的ERα 基因启动子区甲基化率的比较采用单因素方差分析及SNK-q 检验，性别构成的比较采用χ2检验。以ERα 基因甲基化率为因变量，尿氟、血清钙水平、年龄、性别(赋值:男性=1，女性=2)为自变量做多重线性回归进行影响因素筛选，对主要影响因素血清钙水平与ERα 基因启动子区甲基化率进行相关分析。检验水准α =0．05。

2 结果

2．1 不同组别儿童基本变量的分析 结果见表2。调查地区儿童氟斑牙患病率为51．15%。由表2 可知，不同氟斑牙分度的儿童年龄差异无统计学意义，性别构成差异有统计学意义。中重度组儿童尿氟水平高于正常组和轻度组。轻度组儿童血清钙水平低于正常组。

表2 3组儿童基本变量的比较

2．2 不同组别儿童ERα 基因启动子区甲基化率比较 结果见表3。由表3 可知，不同组别儿童甲基化率差异无统计学意义。3组男性儿童ERα 基因启动子区甲基化率差异有统计学意义，且中重度组儿童高于正常组儿童。3组女性儿童ERα 基因启动子区甲基化率差异无统计学意义。

表3 3组ERα 基因启动子区甲基化率比较 %

2．3 ERα 基因启动子区甲基化率与血清钙水平的相关分析 结果显示:血清钙为ERα 基因启动子区甲基化率的影响因素(t =2．281，P =0．024)。对ERα 基因启动子区甲基化率与血清钙水平进行相关分析，结果为:r= －0．172，P=0．024。

3 讨论

3．1 血清钙水平与儿童氟斑牙 该研究发现氟病区轻度氟斑牙患儿血清钙水平较非患儿降低，但中重度组与正常组儿童比较，差异无统计学意义，与史晓红等［10］的研究结果一致。高氟与肠道和血液中的钙离子结合形成氟化物，影响钙的吸收和沉积，进而引起血钙暂时性降低可能是其主要原因。高氟和低钙共同作用使甲状旁腺激素分泌增多，促进破骨细胞骨转换作用加快，是血钙在氟斑牙患病后期又趋于正常的原因。有研究［11］发现:用氟化钠喂饲的小鼠60 d 内血清钙离子水平较正常饲养的小鼠低，而60 d 后血清钙水平又上升。李广生等［12］提出的地方性氟中毒属于“钙矛盾疾病”的观点指出:细胞内钙离子的增多可能是低钙加重氟中毒的重要机制，低水平氟对钙泵的作用是正性作用，而随着氟水平的升高，钙泵的活性明显下降，反映出一种非线性的或前后矛盾的“全剂量-效应”钙曲线趋势，又称U型剂量反应，也是钙水平恢复的原因之一。

3．2 血清钙水平与ERα 基因启动子区甲基化率的关系 该研究发现，血清钙水平与ERα 基因启动子区甲基化率呈负相关，即随着ERα 基因启动子区甲基化率的升高，血清钙水平有下降趋势。关于血清钙与ERα 基因启动子区甲基化水平的关系，以往研究比较少。有研究［5］发现雌激素缺乏可导致骨质疏松，ERα 基因启动子区甲基化水平在绝经后妇女显著高于绝经前的妇女。产生这种关系的可能原因是，ERα 基因启动子区甲基化使ERα 基因表达降低或者沉默，引起雌激素抵抗［13］，使雌激素对肠道钙离子的吸收及肾小管对钙离子重吸收的促进作用减弱，且对钙离子的排泄作用增强［14-15］，从而引起血清钙水平下降。

3．3 儿童氟斑牙与ERα 基因启动子区甲基化率的关系 该研究发现，随着氟斑牙患病程度的加重，ERα 基因启动子区甲基化率有升高趋势，但差异无统计学意义，且这种变化具有性别差异，表现为中重度组男性儿童ERα 基因启动子区甲基化率高于正常组和轻度组儿童。目前尚缺乏ERα 基因甲基化与氟斑牙关系的研究，但有研究［16］表明雌激素对骨骼发育的影响十分明显，特别是对刺激成骨细胞活动、促进钙磷的骨内沉积具有重要作用。牙齿的形成与骨骼有相似之处，氟斑牙的某些病理改变也与氟骨症相似。以往研究［17-18］发现，ERα 基因启动子区甲基化水平与其转录活性呈负相关，甲基化水平升高导致ERα 表达下调或沉默，进而影响雌激素的作用。该研究还发现，ERα 基因启动子区甲基化率与血清钙离子水平呈负相关，提示ERα 基因甲基化可能影响机体钙代谢，从而参与氟斑牙的形成。由于该研究为氟斑牙与表观遗传改变的探索性研究，涉及样本含量较小，因此，需要进一步扩大研究范围，增加样本含量以验证研究结果，为氟中毒发生的表观遗传机制研究提供新的思路。

致谢:感谢参与课题现场调查工作的郑州大学公共卫生学院、开封市疾病预防控制中心及通许县疾病预防控制中心地方病科的工作人员;感谢所有参与此项研究的调查对象。

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