甘草等中药对变异链球菌作用的初步研究

(天津医科大学临床医学院 天津 300070)

龋病是细菌性疾病,可以继发牙髓炎和根尖周炎,甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。龋病特点是发病率高,分布广。是口腔主要的常见病,也是人类最普遍的疾病之一,世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。

牙菌斑则为龋病发生的始动因子,其为基质包裹的互相粘附、或粘附于牙面、牙间或修复体表面的软而未矿化的细菌性群体,为不能被水冲去或漱掉的一种细菌性生物膜。牙菌斑生物膜能够容纳多种多样的菌属生存其中,其成层的结构中包含了对氧敏感性不同的需氧菌、兼性厌氧菌和绝对厌氧菌。而其中尤以变异链球菌为致龋优势菌,故本课题从中药体外抑制变异链球菌入手,以期可有效地降低龋病等口腔疾病的发生率。

近年来,随着各相关学科的飞速发展,对中药及其有效成分具体作用机理的研究有了长足进展。在一定程度上揭示了抗炎特点及对各系统的影响。与现代药理学相对应,中药抗炎的机理研究一般从对下丘脑-垂体-肾上腺皮质釉的影响、干扰花生四烯酸代谢及抗组胺效应、免疫抑制等几方面进行。此外还有从抑制白细胞活化、抗血小板等方面的阐释。甘草等中药的抗炎机理与临床应用是当今世界新药开发的热点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

变异链球菌培养基、高压蒸汽灭菌锅、米基炉、一次性培养皿、牙菌斑染色剂、口腔探针、牙菌斑染色剂、布氏漏斗、药敏片、青霉素瓶、中药液瓶、玻璃棒、镊子、滤纸、牛皮纸、打孔器、游标卡尺。

表1 变异链球菌生化鉴定表

表2 多种中药对变异链球菌抑制作用数据

1.2 实验方法

1.2.1 培养细菌

称取粉末状培养基,取蒸馏水。轻轻摇匀,直至水中无肉眼可见颗粒。加热煮沸,使其完全溶解。121.3℃高温灭菌15分钟。将灭菌后的培养基冷却至50℃左右,以无菌操作倾注于一次性培养皿(直径70mm的平皿),待培养基凝固后将器皿翻转,至4℃保存使用。

选择全身健康状况良好,全口不得少于20颗功能牙,试验前3个月内未服用抗生素和使用漱口液,受试牙发育正常的志愿者。要求志愿者48h不刷牙。咀嚼牙菌斑染色剂三分钟,清水漱口,探针刮取牙菌斑,溶于生理盐水中。

用接种环蘸取有菌的生理盐水,用连续划线分离法将菌斑接种到变异链球菌选择培养基上。将培养基置于CO2恒温箱(CO25%,温度37℃),培养24小时作为第一代。继而纯化;使用液体培养基富集;后进行传代,依次培养。

1.2.2 中药有效成分制备

查阅《本草纲目》、《中国药典》等中草药书籍,挑选出大青叶、竹叶、柴胡、丹皮、麦冬、土茯苓、板蓝根、苦参、射干、紫草、穿心莲、龙葵、鱼腥草、秦皮、狗脊、山慈菇、玄参十七种中药。所选中药均具有抗炎杀菌,清热解毒且禁忌症较少特性,适宜人群较为广泛。将中药碾磨成粉。以甘草为例:取甘草粉末20.0克,加入110毫升75%乙醇,加入少许沸石,磁力搅拌电热套加热回流2小时,温度(80℃—85℃)。2小时后用布氏漏斗进行抽滤,得深棕色滤液,滤液进行减压冷凝,温度同上,直至无醇味,馏出液滴出缓慢为止。滤渣再次进行加热回流半小时,抽滤,弃去滤渣,滤液同样进行减压冷凝。将两次的药液合并得粗品液,约18毫升。将粗品液均分为两份,各9毫升,一份直接用于制备药敏片,另一份进行萃取。

图1 临床分离株革兰染色,箭头所指为变异链球菌 X1000

图2 甘草抑菌圈效果

将粗品液倒入分液漏斗,加入25毫升氯仿,充分振摇,放气,重复三次,静置放液。弃上层液,放出下层液,做减压冷凝,蒸出氯仿,温度控制在60摄氏度左右。得到的萃取药液。

1.2.3 制作药敏片

用打孔器制作药敏片,每个青霉素瓶内放20片。在鼓风干燥箱里35℃干燥24h直至烘干。每味药(萃取及粗体品)各取一支消毒的注射器,抽取适量中药液(以完全浸透药片为准),注入青霉素瓶中,摇匀使药液充分浸透半小时,将瓶口用已消毒的牛皮纸封口包扎,在35～40℃恒温箱内过夜烘干。置于4-6℃冰箱里冷藏备用。

以药敏试验法利用药敏片半径扩散法检测其是否有抗菌作用,比较同一中药不同纯度药液(萃取与粗体)对变异链球菌活性的影响,确定适宜提取方法。

2 结果与分析

2.1 菌落检测及细菌形态学鉴定

菌落肉眼观察结果:细菌初代培养时,培养基上的菌落为较小的粉色菌落,边界清楚。细菌次代纯化培养后,经革兰染色,镜下观察可见,菌落为革兰阳性小球菌,多呈短链状,成对或分散排列。(如图一)。

2.2 细菌生化鉴定

对形态学观察具有变异链球菌典型形态的临床分离株,进行传统的生化鉴定.甘露醇、山梨醇、棉子糖和密二糖的发酵实验阳性者为黄色,七叶苷水解实验阳性者为黑色,加3%过氧化氢后产生大量气泡者为触媒实验阳性。主要特性见表一。

2.3 药敏片对细菌的抑菌作用

二十种药液对变异链球菌进行体外抑菌试验后,结果表明甘草粗提液对变异链球菌抑制效果最好,大青叶、秦皮也均出现较为明显抑菌圈。(见表二)其余中药对变异链球菌产生作用较微弱,抑菌圈小于7mm,无统计学意义,故不在此赘述。

图二为甘草药敏片置于培养皿上24h后,在涂布有变异链球菌的培养皿上的抑菌效果。说明甘草药液中含有的抗菌物质对变异链球菌不仅有效,而且效果最优。在抑菌时间上,甘草药敏片24h即可表现出明显的抑菌效果。

图中箭头所指为甘草药敏片抑菌圈

3 讨论

甘草著于《中华草本》,其功效益气补中;缓急止痛;润肺止咳;泻火解毒;调和诸药。主倦怠食少等。西医药理发现,甘草剂有抗炎和抗变态反应的功能,因此在西医临床上主要作为缓和剂。缓解咳嗽,祛痰,治疗咽痛喉炎;对慢性肾上腺皮质功能减退症有良好功效;甘草制剂能促进胃部粘液形成和分泌,延长上皮细胞寿命,有抗炎活性,常用于慢性溃疡和十二指肠溃疡的治疗;甘草的黄酮具有消炎、解痉和抗酸作用;甘草也是人丹的主要原料之一。

经本实验研究发现甘草对变异链球菌有抑制作用,可深入研究探讨其对口腔龋病的治疗效果。

[1] 霍丽珺《:特异性靶向抗菌肽的抗变异链球菌作用》《,国际口腔医学杂志》,2009年第5期.

[2]郑曙明,黄建军,吴青,沙莎.复方五倍子有效成分的分离鉴定及抑茵活性研究[J].水生生物学报.2010,34(1):57-62.

[3]李娜,五倍子单宁酸对变异链球菌作用的初步研究.

[4]刘源,周学东.变异链球菌的微生态学研究进展[J].国际口腔医学杂志,2008,35(5):502-506.

[5]张变异链球菌生长和产酸影响的体外研究.菲菲,甘草水煎剂对.