DNA 条形码在紫斑谷螟幼虫鉴定中的应用

郭凤娟，阳建春，胡诗佳，苏栋栋，李咏施

(广东省昆虫研究所华南野生动物物种鉴定中心，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东省农业害虫综合治理重点实验室，广州 510260)

紫斑谷螟Pyralis farinalis 又名粉螟、粉缟螟、大斑粉螟、缟螟蛾，属鳞翅目Lepidoptera 螟蛾科Pyralidae 螟蛾亚科Pyralinae 螟蛾属Pyralis 的昆虫，全世界广泛分布(王平远，1980;王永卫，1982;尚小丽，2011)。紫斑谷螟作为主要的仓库害虫之一(赵养昌，1982)，它主要为害仓库中的小麦、稻米、高粱、玉米、黄豆、麸皮等，造成严重的经济损失。

仓库害虫种类繁多，为了有效控制仓库害虫的发生，首先要对其物种做出正确鉴别。利用传统的形态学方法进行物种鉴定具有一定的局限性，因为不仅要求虫体外形完整，而且对不同生长期的虫体进行正确鉴定需要较强的专业知识和丰富的经验。DNA 条形码的产生，为物种鉴定提供了新的研究方法和手段(Frézal，2008)。2003年Hebert 首次将DNA 条形码技术应用在约200个亲缘关系较近的鳞翅目昆虫的分类鉴定中，结果成功地鉴别出了这些鳞翅目昆虫(李青青，2010)。目前，专为鳞翅目昆虫而建的DNA 条形码网站已收录了22175个物种的510897 条DNA 条形码序列，为科研工作者提供了大量的科研素材。在过去的研究中，紫斑谷螟仅被作为仓库害虫加以记录。近年来有研究者发现，紫斑谷螟是生产虫茶的主要昆虫种类，并对其形态特征和生物学特性进行了详细的观察(尚小丽，2011)。目前，尚未有研究者通过分子生物学方法来研究紫斑谷螟及其幼虫。本文旨在利用DNA 条形码技术鉴定残缺的紫斑谷螟幼虫，为仓库害虫的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与方法

1 份残缺的昆虫幼体来自于广州市某动物食品公司仓库。

1.2 DNA 提取

将残缺的昆虫幼体置于灭菌的1.5 mL EP 管内，用PBS 缓冲液清洗样品，去除污垢，离心去上清，用灭菌的眼科剪将沉淀剪成小碎块，然后使用Biomage 公司的基因组DNA 小量提取试剂盒进行操作，提取样品组织中的DNA。

1.3 PCR 扩增

以DNA 条形码通用引物LCO1490/HCO 2198(上游引物LCO1490 碱基序列为5'-GGTCAAC AAATCATAAAGATATTGG-3'下游引物HCO2198碱基序列为5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAA TCA-3')(Hebert，2003)进行PCR 扩增。反应体系采用50 μL，其中10 μM/mL 上下游引物各2 μL，Premix Taq 25 μL，DNA 模板5 μL，最后用灭菌水补至50 μL。扩增体系为94℃预变性1 min;94℃变性1 min，45℃复性1 min 30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环次数为5;第一次循环结束后进入第二次循环:94℃变性1 min，50℃复性1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环次数为35，最后72℃延伸7 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上分析电泳结果。PCR 产物送上海英潍捷基公司进行纯化并测序。

1.4 序列比对及分析

用BioEdit 软件打开测序获得的序列，观察序列峰图，将两端的低信号序列和出现双峰的碱基弃掉，得到约660 bp 的样品序列，输入NCBI 数据库中进行序列比对。然后将样品序列与从GenBank数据库中下载的螟蛾属5个种的14 条已知序列(见表1)导入BioEdit 软件中，对已知序列和样品序列进行整合，以ClustalW Multiple Alignment 进行对齐处理。用MEGE 6.05 分析序列的变异位点、碱基组成，以Kimura 双参数模型计算种内及种间遗传距离。利用MEGE 6.05 软件中的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，对各分支置信度(bootstrap)进行1000 次以上的重复检验。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增结果

以残缺昆虫幼虫的基因组DNA 为模板，利用DNA 条形码通用引物LCO1490/HCO 2198 扩增线粒体COⅠ基因片段，PCR 产物在1.0%琼脂糖凝胶中的电泳结果如图1 所示，从送检样品中能扩增到目的基因的条带。经纯化、测序后得到约660 bp长度的序列。

图1 COⅠ通用引物PCR 扩增产物电泳图谱Fig.1 Agarose electrophoresis pattern of universal primer-directed PCR

2.2 序列比对分析

样品序列经与NCBI 数据库中的序列比对发现，样品序列与紫斑谷螟的序列相似性最高。然后将样品序列与下载的14 条序列经软件分析后，得到639 bp 的序列，其中保守位点504个，可变位点135个，简约位点134个，单个突变位点1个。样品序列的碱基含量为40.1%T，18.6%C，26.1%A，15.2%G，A+T 含量为66.2%，C+G含量为33.8%，存在明显的A、T 碱基偏好性。

不同种序列之间比对结果发现(见表2)，5种螟蛾的种间遗传距离为0.066-0.162，平均为0.127，种内遗传距离为0.000-0.003，平均为0.001。种间遗传距离远远大于种内遗传距离，COⅠ基因能够有效的区别该类物种。样品序列与紫斑谷螟的序列相似性最高，达到99.8%，遗传距离最小，为0.002-0.003。

2.3 构建系统发育树

基于K2P 模型，使用邻接法构建系统发育树，并对各分支置信度(bootstrap)进行1000 次以上的重复检验。结果显示(见图2)，残缺的幼虫样品与紫斑谷螟聚为一支。

表1 下载的GenBank 数据库中5种螟蛾COⅠ基因片段相关信息Table1 The COⅠgene information of five species of Pyralis from GenBank database

图2 基于COⅠ基因部分序列以邻接法构建的5种螟蛾属昆虫系统发育树(以玉米螟为外群)Fig.2 The phylogenic tree of five Pyralis constructed with Neighbor-Joining method based on COⅠpartial sequence(Ostrinia nubilalis as outgroup)

3 结论与讨论

DNA 条形码自提出以来，已经在多个类群的研究中得到应用。包括鸟类、兽类、两栖爬行类、植物(Kress and Erickson，2007)、真菌(Seifert et al.，2007)、鱼类(Ward et al.，2005)、昆虫等。近年来，也有大量关于鳞翅目昆虫DNA 条形码的研究。Hebert 等首次将DNA 条形码技术应用于约200个鳞翅目近缘种的分类鉴别中，并成功的鉴别了这些昆虫。Hajibabaei 等利用DNA 条形码对哥达加斯加西北地区的521种已通过形态学鉴定的鳞翅目昆虫进行物种鉴定，发现97.9%的物种可以用COⅠ基因进行区别鉴定(2006)。濮佳明(2009)研究表明DNA 条形码可用于鳞翅目昆虫柳蚕种质资源的分子鉴定，且适用于柳蚕各发育阶段材料的分析。

DNA 条形码作为物种鉴定和分类的有利工具，不仅极大的简化了物种分类和鉴定工作，同时也弥补了形态学分类方法的不足。在DNA 条形码广泛应用的同时，部分学者也提出了质疑。他们认为DNA 条形码作为物种分类鉴定的依据，其基因片段单一，应适当增加一些其他的基因序列信息，另外，由于核基因组中的线粒体假基因的存在会对PCR 扩增线粒体基因片段有影响，故采用多个方法或基因进行物种鉴定会更加科学和准确。

本研究以未知昆虫的残缺幼虫作为样本，利用DNA 条形码对该样本进行了快速而准确的鉴定。通过将未知样品序列与5种螟蛾的14 条序列比对发现，未知样品序列与紫斑谷螟的序列相似性最高，达到99.8%。5种螟蛾的种间遗传距离为0.066-0.162，平均为0.127，种内遗传距离为0.000-0.003，平均为0.001，种间遗传距离远远大于种内遗传距离。Hebert 等根据对鳞翅目部分种类的研究结果发现，种内遗传距离一般都低于1%，同属种间遗传距离平均为6.8%，本研究中螟蛾属5个种的种内遗传距离均低于1%，平均种间遗传距离则比6.8%大，表明COⅠ基因能够用于该类物种的分类鉴定。

仓库害虫种类繁多，分布广、危害大、对环境的适应性强，往往造成严重的经济损失。我国是世界上仓储技术发展最早的国家之一，在仓库害虫的研究和防治上具有悠久的历史，积累了丰富的经验(李隆术和赵志模，2000)。准确的物种鉴定为仓库害虫的防治提供了可靠的理论基础，也为研究人员研制更有效的防治方法提供了素材。

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