亚洲柑橘木虱和柚喀木虱过冷却点和体液结冰点测定

黄治轶，徐昊昱，杜源良，杨玉枝，乌天宇，曾丽霞，Yu-Lu XIA，岑伊静*

(1.华南农业大学昆虫生态研究室，广州 510642;2.Center for Integrated Pest Management，North Carolina State University，Raleigh，NC 27606，USA)

亚洲柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama 是柑橘生产上最具毁灭性的病害——柑桔黄龙病(huanglongbing，HLB)亚洲种Candidatus liberibacter asiaticus 的主要传播媒介，给世界柑橘生产带来严重威胁(Bové，2006)。柚喀木虱 Cacopsylla citrisuga Yang ＆ Li 于1984年由杨集昆和李法圣(1984)首次记录，2012年发现也携带黄龙病亚洲种的病原菌(Cen et al.，2012)。亚洲柑橘木虱广泛分布在亚洲和美洲地区。在中国，20 世纪初主要分布于广东、广西、福建、台湾等省，但随着全球气候变暖，木虱北迁，现已在江西、四川、湖南、贵州、浙江等地广泛蔓延(杜丹超等，2011)。现已报道在我国发生于11个省区。柑橘木虱分布区受气候等因子影响在我国出现了明显北移，对我国部分优势柑橘产区生产安全构成了较大威胁(熊红利等，2011)。

柑橘木虱发生与海拔高度有一定的关系，低海拔地区发生比较严重(赵学源等，1979)，而柚喀木虱目前仅发现于1000 m 以上的高海拔地区(郭俊等，2012)。我国柑桔产业有向西南方向扩展的趋势，柚喀木虱的存在可能对这些高海拔地区的柑桔产业造成严重威胁。针对两种木虱分别适应于高海拔、低海拔生态环境的这一特殊机制展开初步研究，明确黄龙病媒介昆虫的耐寒性，为进一步研究其传病机制和进行有效防治提供依据，是减少这两种木虱对我国柑桔产业造成威胁的前提。昆虫的过冷却现象是昆虫耐寒力的重要指标之一(李冰祥等，1998;鞠瑞亭和杜予州，2002;景晓红和康乐，2004;王锦林等，2013)，尽管有些昆虫在过冷却点以上死亡，导致过冷却点不足以作为一个最可依赖的耐寒性指标，但是多数昆虫死亡发生的过程都处在体液溶点以下的过冷却状态，因此考察过冷却点是研究昆虫耐寒性的一个必要的工作，它有助于全面地理解昆虫的耐寒性(景晓红和康乐，2004)。谢佩华等(1988)曾对柑桔木虱的耐寒性开展了初步研究，而柚喀木虱的耐寒性未见报道。本文测定了柑橘木虱和柚喀木虱各龄若虫和成虫的过冷却点和冰点，以期为分析两种木虱的耐寒能力、适生区域及其传播黄龙病的风险提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

柑橘木虱采自广州市天河区华南农业大学校园，寄主为九里香Murraya exotica L.，采回区分虫态后直接用于测定。柚喀木虱采自云南省瑞丽户岛，寄主为尤力克柠檬Citrus limon.(L.)Burm.F.，采集到的成虫直接用于测定，若虫则与寄主柠檬嫩梢一起置于4℃冰箱内保存，测定前取出在室温下放置1 h，若虫测定时间历时约1 周。

分别参照郭俊等(2012)与黄邦侃(1956)、阮传清等(2012)的数据在体视镜下区分柑橘木虱和柚喀木虱若虫的龄期，主要根据若虫的体型大小、体色、翅芽分化程度进行鉴定。

1.2 实验仪器

SUN-V 型昆虫过冷却点测定仪及配套软件(北京鹏程电子科技中心生产)，BCD539-WT 型Haier 冰箱，MDF-U5411 型SANYO 超低温冰箱。

1.3 过冷却点、冰点的测定方法

将超低温冰箱调至-40℃，将试虫置于塞有少量棉花的移液枪枪头中，把近热敏探头的导线塞于一段吸管中，使塞入测温计热敏探头于枪头时，能固定在枪头内并恰好紧贴虫体，测定柑橘木虱1 龄、2 龄、3 龄、4 龄、5 龄若虫和成虫以及柚喀木虱1 龄、2 龄、3 龄、4 龄、5 龄若虫和成虫的过冷却点及冰点。每个虫态都用单头进行测定，共测定30 头。但由于柚喀木虱1、2、5 龄若虫虫源不足，分别测定了28、27、29 头。其中，可能由于柑橘木虱1 龄若虫虫体太小，温度变化曲线图上峰不明显，故在确保1 龄若虫能降至相同低温的前提下，使用导体锡箔纸包裹枪头，延缓1龄若虫体温下降速度，从而测得结果。柑桔木虱成虫未分性别随机采样测定了30 头后，分别采雌、雄各30 头进行测定和比较。

1.4 统计分析

采用统计分析软件DPS(7.05)对数据多组比较经方差分析后，再用Duncan 多重比较进行差异显著性测定。

2 结果与分析

2.1 柑橘木虱不同虫态的过冷却点和结冰点比较

柑橘木虱不同虫态的过冷却点和结冰点如图1所示。由图可见不同虫态过冷却点存在一定差异。其中，1 龄若虫的过冷却点最低，平均值为-26.32℃;其次为2 龄若虫，平均值为-24.76℃;其它各龄若虫过冷却点由低到高依次为4 龄若虫、5 龄若虫、3 龄若虫，但这3个龄期之间差异不显著。成虫的过冷却点最高，平均值为-19.60℃，显著高于各龄若虫。

各虫态的结冰点都略高于过冷却点，变化趋势与过冷却点基本一致，冰点温度由低到高依次为1 龄若虫＜2 龄若虫＜4 龄若虫＜3 龄若虫＜5 龄若虫＜成虫，1 龄若虫的冰点最低，平均值为-26.22℃;成虫的最高，平均值为19.71℃;3 龄和4 龄、3 龄和5 龄若虫之间差异不显著，各龄若虫的冰点也都显著低于成虫。说明柑桔木虱的耐寒能力有随着发育阶段增加而下降的趋势，1 龄若虫最强，而成虫最弱。

图1 柑橘木虱不同虫态的过冷却点和体液结冰点Fig.1 Supercooling points and freezing points of different stages of Diaphorina citri

2.2 柚喀木虱不同虫态的过冷却点和结冰点比较

由图2 可知柚喀木虱不同虫态过冷却点和冰点亦存在一定差异。过冷却点变化趋势为1 龄若虫＜2 龄若虫＜3 龄若虫＜4 龄若虫＜成虫＜5 龄若虫，1 龄若虫过冷却点最低，为-25.30℃，5 龄若虫最高，为-19.50℃(表1)。1-3 龄若虫的过冷却点之间差异不显著，都显著低于高龄若虫和成虫。4 龄若虫与成虫亦无显著差异。

各虫态的结冰点变化趋势与过冷却点基本一致，冰点温度由低到高依次为1 龄若虫＜2 龄若虫＜3 龄若虫＜4 龄若虫＜成虫＜5 龄若虫(图2)，平均值分别为-25.08℃、-24.45℃、-23.75℃、-19.52℃、-19.40℃、-17.69℃(表1)。1 龄和2 龄若虫最低，两者差异不显著;5 龄若虫最高;4 龄若虫与成虫冰点温度差异不显著。说明除成虫外，柚喀木虱耐寒力也有随着发育阶段增加而降低的趋势，1 龄和2 龄若虫最强，而5 龄若虫最弱。

图2 柚喀木虱不同虫态的过冷却点和体液结冰点Fig.2 Supercooling points and freezing points of different stages of Cacopsylla citrisuga

表1 柑橘木虱、柚喀木虱各虫态的过冷却点和体液结冰点的比较Table 1 Comparison of supercooling points sndfreezing points of different stages of Diaphorina citri and Cacopsylla citrisuga

2.3 柑橘木虱与柚喀木虱的过冷却点和冰点比较

测定结果表明，柑橘木虱、柚喀木虱各虫态的过冷却点和冰点存在一定差异，但各虫态表现不一致。柑橘木虱1 龄、4 龄、5 龄若虫的过冷却点和冰点均显著低于柚喀木虱，而3 龄若虫的过冷却点与冰点、成虫的过冷却点却显著高于柚喀木虱(表1)。

2.4 柑橘木虱雌成虫与雄成虫的过冷却点和体液结冰点比较

在测定柑橘木虱雌成虫与雄成虫时，测得雌成虫的过冷却点最低达到-22.16℃，雄成虫的过冷却点最低为-22.38℃，平均值分别为-20.06℃和-19.47℃，二者之间不存在显著差异;雌成虫的冰点平均值为-19.20℃，雄成虫的冰点平均为-18.79℃，二者亦无显著差异(表2)。

表2 柑橘木虱雌、雄成虫的过冷却点和体液结冰点Table 2 Supercooling points and freezing points of different genders of Diaphorina citri

3 结论与讨论

本文首次测定了柑橘木虱和柚喀木虱各龄期若虫和成虫的过冷却点和体液结冰点。结果表明，两种木虱各虫态的过冷却点及冰点均以1 龄若虫最低，分别为-26.32℃和-25.30℃。柑橘木虱过冷却点由低到高依次为1 龄若虫＜2 龄若虫＜4 龄若虫＜5 龄若虫＜3 龄若虫＜成虫;柚喀木虱为1 龄若虫＜2 龄若虫＜3 龄若虫＜4 龄若虫＜成虫＜5 龄若虫。两种木虱的过冷却点明显低于橡副珠蜡蚧 Parasaissetia nigra Nietner、扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley、桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)等分布于我国南方的昆虫(侯柏华和张润杰，2007;关鑫等，2009;张方平等，2013)，甚至低于梨小食心虫Grapholitha molesta Busck、小胸鳖甲Microdera punctipennis Kaszab、桃蛀螟Dichocrocis punctiferalis Guenée 等多种主要分布在东北、西北、华北的北方昆虫(鹿金秋等，2009;刘晓静等，2012;郭婷婷等，2013)，说明两种木虱的过冷却点很低，可能具有较强的耐寒能力，存在更广泛的生存区域。

谢佩华等(1988)在实验室测定了柑橘木虱的耐寒性，结果表明，越冬成虫无论是雄性或雌性都具备了较强的耐寒能力，大约能承受-18℃的低温10 min，-4℃至-12℃的低温4 h，经模拟低温测定和自然低温观察，柑桔木虱经过极端最低气温-10℃时也不会全部死亡。2008年中国遇到冰冻灾害天气，广西从1月12-13日至2月10-13日出现长达近20 d 的低温阴雨冰冻天气，对当年广西越冬成虫的存活率调查结果表明，木虱在桂南、桂中、桂北的死亡率分别为34%、54%、85%(邓铁军等，2008)，但北纬25 度以上全部越冬木虱被冻死(白先进等，2008)。桂林在此期间低于5、4、3、2、1、0、-1℃以下的天数分别为40、37、35、29、21、8、2 d，陈 贵 峰 等(2010)调查柑桔木虱平均死亡率达到99.93%，但两个有残存活虫观察区的种群数量3个月后即得到恢复。这些结果都说明了柑桔木虱具有较强的耐寒能力。郭俊等(2012)调查了柚喀木虱的生物学特性，结果表明柚喀木虱在4℃低温下48 h后仍然具有活动和取食能力;置于0℃4 h 后，转移到室温几秒钟就能恢复活动能力，说明该木虱耐寒能力也较强。

本文测到的柑桔木虱成虫过冷却点、冰点分别为-19.60±0.17℃和-18.71±0.16℃，谢佩华等(1988)测到的越冬成虫过冷却点为-17.4±2.78℃，冰点为-15.75±2.77℃，即本研究获得的结果更低，其原因可能是与1988年相比目前柑桔木虱的抗寒能力有所提高，或者由于种群不同所致。季节性气候变化、地理分布区、环境湿度、低温快速冷驯化、光周期等环境因子和昆虫生理状态、发育阶段、寄主植物、人为因素等生物因子都可能影响昆虫的过冷却点和耐寒能力(王锦林等，2013)。

本文还测定了柑橘木虱雌成虫与雄成虫的过冷却点和结冰点，发现两者差异不显著。吕宝乾等(2011)比较了椰甲截脉姬小蜂 Asecodes hispinarum Boucek 和椰扁甲啮小蜂Tetrastichus brontispae Boucek 雌雄成虫的过冷却点和结冰点，关鑫等(2009)、刘亚军和李传仁(2009)、赵琦等(2011)分别对扶桑绵粉蚧、悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliata Say、旋幽夜蛾Scotogrammatrif olii Rottemberg 的雌雄成虫过冷却点和结冰点进行了测定，结果也显示雌雄成虫之间差异不显著，估计这与雌雄虫之间的生理适应性相关。

由于自然条件下柚喀木虱在广州无法繁殖，所以本研究将从云南瑞丽采集到的带有柚喀木虱若虫的柠檬嫩梢置于4℃冰箱中保存以延长其存活期，取出后在室温条件下放置1 h 后进行测定，可能对若虫的测定结果有一定影响。此外，由于两种木虱的卵粒太小，单头测定时无法获得准确的数据，故本研究没有进行测定，卵的耐寒能力有待进一步研究。过冷却点高低是昆虫耐寒能力高低的指标之一，但一般不能作为昆虫存活的低温下限。全面评价昆虫的耐寒能力还需要进行低温存活率实验，测定致死中温度或致死中时间、冷伤害上限温度和有效低温总和等指标(景晓红和康乐，2004)。因此，与黄龙病相关的两种木虱耐寒能力还需进一步研究和进行综合的评价。

References)

Bai XJ，Deng CL，Lu GB，et al.Survey on the cold hardiness of Diaphorina citri Kuwayama［J］.South China Fruits，2008，37(6):22-24.［白先进，邓崇岭，陆国保，等.柑桔木虱耐寒性调查研究［J］.中国南方果树，2008，37(6):22-24］

Bové JM.Huanglongbing:A destructive，newly emerging，century-old disease of citrus［J］.Journal of Plant Pathology，2006，88(1):7-37.

Cen YJ，Zhang LN，Xia YL.Detection of“Candidatus Liberibacter asiaticus”in Cacopsylla(Psylla)citrisuga(Hemiptera:Psyllidae)［J］.Florida Entomologist，2012，95(2):303-309.

Chen GF，Deng MX，Tang ML，et al.Observation of the population dynamics of overwintering adults of Diaphorina citri Kuwayama in winter and spring［J］.South China Fruits，2010，39(4):36-38.［陈贵峰，邓明学，唐明丽，等.柑桔木虱越冬成虫冬春季种群数量动态观察［J］.中国南方果树，2010，39(4):36-38］

Deng TJ，Wang KX，Tan GL.Influence of the snow disaster on overwintering survival rate and strategy of post-disaster management of Diaphorina citri Kuwayama［J］.Journal of Guangxi Agriculture，2008，23(Suppl.Ⅰ):51-53.［邓铁军，王凯学，覃贵亮.冰冻灾害对柑桔木虱越冬存活率的影响和灾后防治对策［J］.广西农学报，2008，23(增Ⅰ):51-53］

Du DC，Lu LM，Zhang LP，et al.Research progress in control technology of Diaphorina citri［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2011，27(25):178-181.［杜丹超，鹿连明，张利平，等.柑橘木虱的防治技术研究进展［J］.中国农学通报，2011，27(25):178-181］

Guan X，Lu YY，Zeng L，et al.Supercooling points and freezing points of mealybug Phenacocus solenopsis Tinsley［J］.Journal of Environmental Entomology，2009，31(4):381-384.［关鑫，陆永跃，曾玲，等.扶桑绵粉蚧的过冷却点和体液结冰点的测定［J］.环境昆虫学报，2009，31(4):381-384］

Guo J，Cen YJ，Wang ZR，et al.A study on the morphology，biology and occurrence of Cacopsylla citrisuga［J］.Journal of South China Agricultural University，2012，33(4):475-479.［郭俊，岑伊静，王自然，等.柚喀木虱的形态、生物学特性及发生规律研究［J］.华南农业大学学报，2012，33(4):475-479］

Guo TT，Ling F，Zhang SY，et al.The super-cooling ability and biochemical substances in diapausing and non-diapausing larvae of Grapholitha molesta(Busck)(Lepidoptera:Tortricidae)［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2013，50(6):1514-1518.［郭婷婷，凌飞，张顺益，等.梨小食心虫滞育与非滞育幼虫过冷却能力与体内主要生化物质含量［J］.应用昆虫学报，2013，50(6):1514-1518］

Hou BH，Zhang RJ.Supercooling capacity of the oriental fruit fly，Bactrocera dorsalis(Hendel)(Diptera:Tephritidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2007，50(6):638-643.［侯柏华，张润杰.桔小实蝇不同发育阶段过冷却点的测定［J］.昆虫学报，2007，50(6):638-643］

Huang BK.Preliminary observation of citrus psylla，Diaphorina citri Kuwayama［J］.J.Fujian Agric.Coll.，1953，1(1):7-20.［黄邦侃.柑橘木虱的初步观察［J］.福建农学院学报，1953，1(1):7-20］

Jing XH，Kang L.Overview and evaluation of research methodology for insect cold hardiness［J］.Entomological Knowledge，2004，40(1):7-10.［景晓红，康乐.昆虫耐寒性的测定与评价方法［J］.昆虫知识，2004，40(1):7-10］

Ju RT，Du YZ.Overview of supercooling point determination and cold hardiness mechanism of insect［J］.Wuyi Science Journal，2002，18:252-257.［鞠瑞亭，杜予州.昆虫过冷却点的测定及抗寒机制研究概述［J］.武夷科学，2002，18:252-257］

Li BX，Chen YL，Cai HL.Supercooling and cold hardiness of insect［J］.Entomological Knowledge，1998，35(6):361-363.［李冰祥，陈永林，蔡惠罗.过冷却和昆虫的耐寒性［J］.昆虫知识，1998，35(6):361-363］

Liu XJ，Shi M，Ma J.Analysis and comparison of the supercooling point in larvae of Microdera punctipennis［J］.Xinjiang Agricultural Sciences，2012，49(6):1080-1085.［刘晓静，石萌，马纪.小胸鳖甲各龄期幼虫过冷却点的测定［J］.新疆农业科学，2012，49(6):1080-1085］

Liu YJ，Li CR.Supercooling point of the overwintering populations of Corythucha ciliate［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2009，26(6):898-900.［刘亚军，李传仁.悬铃木方翅网蝽越冬种群的过冷却点测定［J］.昆虫知识，2009，26(6):898-900］

Lu JQ，Wang ZY，He KL，et al.The supercooling point of overwintering larvae of the yellow peach moth Dichocrocis punctiferalis［J］.Plant Protection，2009，35(2):44-47.［鹿金秋，王振营，何康来，等.桃蛀螟越冬老熟幼虫过冷却点测定［J］.植物保护，2009，35(2):44-47］

Lv BQ，Wei ML，Jin QA，et al.Determination of super cooling points and freezing points of Asecodes hispinarum and Tetrastichus brontispae［J］.Chinese Journal of Tropical Crops，2011，32(8):1537-1540.［吕宝乾，韦曼丽，金启安，等.椰心叶甲两种寄生蜂过冷却点及冰点测定［J］.热带作物学报，2011，32(8):1537-1540］

Ruan CQ，Chen JL，Liu B，et al.Morphology and behavior of Asian Citrus Psyllid，Diaphorina citri Kuwayama［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2012，28(31):186-190.［阮传清，陈建利，刘波，等.柑橘木虱主要形态与成虫行为习性观察［J］.中国农学通报，2012，28(31):186-190］

Wang JL，Feng YQ，Zong SX.Review of the hardiness types of insect，their research methodology and impact factors［J］.Anhui Agricultural Science Bulletin，2013，19(9):32-35.［王锦林，冯宇倩，宗世祥.昆虫耐寒性的类型、测定方法及影响因素综述［J］.安徽农学通报，2013，19(9):32-35］

Xie PH，Su CA，Lin ZG.Study on the cold hardiness of Diaphorina citri Kuwayama［J］.Plant Protection，1988，14(2):5-7.［谢佩华，苏朝安，林自国.柑桔木虱耐寒性的研究［J］.植物保护，1988，14(2):5-7］

Xiong HL，Lin YB，Xiang Y，et al.Investigation of the northmost distribution of Citrus Huanglongbing and Diaphorina citri in China［J］.Plant Quarantine，2011，(4):79-80.［熊红利，林云彪，项宇，等.柑橘黄龙病与柑橘木虱在我国发生北界调查［J］.植物检疫，2011，(4):79-80］

Yang JK，Li FS.Nine new species and a new genus of Psyllidae in Yunnan Province［J］.Entomotaxonomia，1984，4(4):251-266.［杨集昆，李法圣.云南木虱科九新种及一新属［J］.昆虫分类学报，1984，4(4):251-266］

Zhang FP，Zhu JH，Han DY，et al.Determination of the supercooling point of Parasaissetia nigra and its parasitoid Metaphycus parasaissetiae［J］.Journal of Environmental Entomology，2013，35(6):827-831.［张方平，朱俊洪，韩冬银等.橡副珠蜡蚧及其寄生蜂过冷却点的测定［J］.环境昆虫学报，2013，35(6):827-831］

Zhao Q，Zhang YH，Han EB，et al.The supercooling point of different stages of the clover cutworm，Scotogramma trifolii［J］.Plant Protection，2011，37(2):63-66.［赵琦，张云慧，韩二宾，等.旋幽夜蛾各虫态的过冷却点测定［J］.植物保护，2011，37(2):63-66］

Zhao XY，Jiang YH，Li SL，et al.A preliminary study on the relationship between the prevalence of the citrus yellow shoot(huanglongbing)and the citrus psyllid，Diaphorina citri Kuwayama［J］.Acta Phytopathologica Sinica，1979，9(2):121-126.［赵学源，蒋元晖，李世菱，等.柑橘木虱(Diaphorina citri Kuwayama)与柑橘黄龙病流行关系的初步研究［J］.植物病理学报，2011，9(2):121-126］