棉大卷叶螟吐丝基因片段的钓取及其意义

陈春霞，王中阳，顾桂香，杨益众*，梁国华

(1.扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009;2.扬州大学教育部功能基因组重点实验室，江苏扬州 225009)

随着转基因棉花在我国的大面积种植，棉田化学农药用量锐减，给棉花种植者和棉田生态环境保护带来了无法估量的利益。然而，化学杀虫剂用量减少后，棉田一些次要害虫有抬头趋势。如棉大卷叶螟，其种群数量在长江中下游部分棉区有所回升(王厚振等，2002;刘芳等，2005;黄东林等，2005)，特别是八月中旬以后的第四代、第五代，种群数量大，卷叶率高，已成为棉花中后期的重要食叶性害虫(陈建等，2008)。关于该害虫的生物学特性、种群动态、发生与不同棉花品种及作物布局间的关系，前人已做过不少研究(康晓霞等，2006;康晓霞等，2007;陈建等，2008;陆佩玲等，2008;Lu et al.，2011)。然而，在转基因棉花的生长后期如何控制棉大卷叶螟的种群密度、减少其为害，必须根据转基因棉花的生长特点，从减少化学农药用量的角度，制定防治该害虫的新举措。论文作者根据家蚕Bombyx mori 后部丝腺中丝素重链、轻链与P25 三种蛋白的性质(汪生鹏等，2009)，利用GenBank已经登录的几种吐丝昆虫轻链基因的保守区域，经过一年多的研究探索，成功地钓取到了棉大卷叶螟的吐丝基因片段，并进行了基因测序。现将部分结果报告于下。

1 材料与方法

1.1 虫源

试验所用棉大卷叶螟虫源采自扬州大学实验农牧场棉田中，幼虫饲以苘麻叶片，幼虫化蛹羽化后每天饲以5%的蜂蜜水，至十月份后，将老熟幼虫至于室外罩笼内，让其自然越冬，以便随时取用。

1.2 相关试剂

1.2.1 PCR 试剂

RNA 提取试剂:Promega 公司的SV Total RNA Isolation System 试剂盒;反转录试剂:TaKaRa 公司的PrimeScriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit 试剂盒;酶:TaKaRa 公司的TaKaRa Taq DNA 聚合酶和TaKaRa LA Taq;胶回收:TaKaRa 公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0 试剂盒。

1.2.2 克隆试剂

载体:TaKaRa 公司的pMD 18-T Vector;氨苄青霉素:上海润兴生物提供;感受态细胞:TaKaRa 公司的E.coli Competent Cells DH5α。

1.2.3 主要试剂的配制

LB 液体培养基:Bacto-tryptone(胰蛋白胨)10.0 g，Bacto-yeast extract(酵母提取物)5.0 g，NaCL 10.0 g，溶解于1 L 超纯水中，120℃，高压灭菌20 min。LB 固体培养基:Bacto-tryptone(胰蛋白胨)10.0 g，Bacto-yeast extract(酵母提取物)5.0 g，NaCL 10.0 g，琼脂粉12.5 g，溶解于1 L超纯水中，120℃，高压灭菌20 min。

1.3 RNA 的提取

参照王勋(2011)。一般流程为:取老熟幼虫1 头加液研磨、裂解、离心、孵育、洗脱、样品保存。

1.4 RNA 的反转录

将样品加入各种反转录液、进行反转录，冰上迅速冷却。

1.5 引物设计

利用GenBank 上已经登录的几种吐丝昆虫轻链基因的保守区域，设计两对兼并引物，Fib-LF1:5'-AATGCTGCCCTTCGTTTT-3'，Fib-L-R1:5'-CACCWACGTTGTTACTGCG-3'和Fib-L-F2:5'-CACCWACGTTGTTACTGCG-3'，Fib-L-R2:5'-CACCWACGTTGTTACTGCG-3'，用于扩增轻链的核心区域。引物由上海生物工程公司合成。

1.6 基因中间片段的扩增

基因中间片段扩增的反应体系为25 μL:

cDNA 2.0 μL

10μM 上游引物 1.25 μL

10μM 下游引物 1.25 μL

2.5 mM dNTP 2 μL

10×PCR Buffer Mg2+plus 4.5 μL

Taq 酶 0.2 μL

ddH2O 13.8 μL

将反应液混匀，放入PCR 仪进行扩增，扩增条件为:

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 胶回收

切出的目的 DNA 片段放入 1.5 mL 的Microtube 中，加入600 μL 的DR-ⅠBuffer(1mg凝胶视为1μL)，65℃加热使胶块完全融化，再加入DR-ⅠBuffer 量的1/2 体积量的DR-ⅡBuffer，均匀混合，离心，最后洗脱DNA。

1.8 体外连接和转化

在Microtube 中配制下列混合液:

回收产物 4.5 μL

连接载体pMD18-T 0.5 μL

SolutionⅠ 5 μL

混合液用枪头打匀后置于4℃冰箱中，反应4 h后进行转化，转化产物均匀打在培养基平板上，37℃培养箱过夜培养。

1.9 菌落筛选和测序

挑取单克隆，在LB 液体培养基中过夜培养后，经菌液PCR 检测后含有特异目的基因的阳性克隆菌液，样品送生工生物工程(上海)有限公司检测。

2 结果与分析

经过研究探索，成功地钓取到了棉大卷叶螟吐丝基因片段，其长度约为600 bp(图1-4)。翻译成的氨基酸序列如图5 所示。

图1 RT-PCR 扩增结果Fig.1 Amplification of fibroin light chain(FLC)gene

图2 胶回收结果Fig.2 The recovery of PCR product FLC gene

图3 使用Fib-L-F1 和Fib-L-R1 引物菌液PCR 结果Fig.3 The result of PCR amplification using the primers of FLC-L-F1 and FLC-L-R1

图4 棉大卷叶螟吐丝基因片段的测序结果Fig.4 FLC gene sequence of Sylepta derogata

图5 棉大卷叶螟吐丝基因片段的氨基酸序列Fig.5 The deduced amino acid sequence of spinning gene fragement from Sylepta derogata

研究结果显示，棉大卷叶螟吐丝基因轻链片长约在600 bp。将本结果得到的碱基序列与NCBI上登陆的一些吐丝昆虫的碱基序列进行比对，结果与外米缀蛾Corcyra cephalonica 的同源性为71%，与大蜡螟Galleria mellonella 的同源性为70%，与家蚕Bombyx mori 的同源性仅为67%。说明棉大卷叶螟的吐丝基因片段有它的个性。

利用(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)估算基因的分子量和等电点，获得的棉大卷叶螟丝素轻链基因相对分子量为53.6 kDa，等电点pI 为5.09。同时利用MEGA软件将氨基酸序列构建基于轻链基因序列的系统进化树，如图6 所示。

图6 基于轻链基因氨基酸序列的系统进化树Fig.6 The phylogenetic tree based on the deduced amino acid sequences of light chain gene

3 结论与讨论

目前对吐丝昆虫的研究主要集中在经济昆虫、社会性(穴居)昆虫及蜘蛛类，其目的是利用或模仿这些昆虫(生物)的吐丝为经济建设和国防事业服务。而本文则将研究目标转移到农林有害吐丝昆虫上，其研究结果为破解众多农林害虫的吐丝、结茧、转移为害机制提供探索的先例。

本文仅是探讨了棉大卷叶螟吐丝基因的轻链片段，要把整个棉大卷叶螟的吐丝基因序列包括重链基因、P25 基因等(Sutherland et al.，2007)全部描述清楚，还需要一个过程。同时，获得的这种吐丝基因片段，如何进行表达，甚至利用基因干扰技术(RNAi)敲除该基因的表达(王志坤等，2008)、从而达到控制害虫吐丝卷叶为害的目的，还有大量的工作需要摸索和阐述清楚。其实，基因干扰技术在植物保护领域的研究与运用已初现端倪。唐涛等研究了RNA 干扰对昆虫抗药性相关基因沉默的作用(唐涛等，2010);周慧丹等运用RNAi 介导法，将两种蛋白基因注入棉铃虫Helicoverpa armigera 幼虫体内，研究基因沉默后对Cry1Ac 毒力的影响，结果干扰后的幼虫对Cry1Ac毒素的敏感性显著下降(周慧丹等，2010)。王志坤等、牛俊海等分别综述了RNA 干扰技术在植物抗病研究、寄生线虫和根结线虫研究中的应用(王志坤等，2008;牛俊海等，2009);杨中侠等、杨广等则较全面地综述了RNAi 技术在昆虫研究中的应用前景(杨中侠等，2008;何正波等，2009;杨广等，2009)。因此，有了轻链基因片段，为今后进一步深入研究和利用生物技术控制此类害虫的为害提供了先期基础。

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