棉铃虫β-catenin 基因的克隆、表达分析及真核表达载体构建

陈 伟，徐卫华

(1.广东药学院生命科学与生物制药学院，广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广州 510006;2.中山大学生命科学学院，有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州 510275)

β-连环蛋白(β-catenin)是一个多功能蛋白，它可以作为细胞骨架蛋白，与E-cadherin 形成复合体，介导细胞间的粘附作用。此外，更为科研工作者所关注的是其在Wnt/β-catenin 信号通路中的作用(Bienz，2005)。β-catenin 是Wnt/β-catenin 信号通路的重要成员，该通路的活性取决于细胞质中自由β-catenin 的多少，自由的β-catenin 可以由细胞质进入细胞核，与T 细胞因/淋巴细胞增强结合因子(TCF/LEF)结合而活化下游靶标基因的转录(Schuijers et al.，2014)。Wnt/β-catenin 信号通路是当前生物学研究的热点之一，该通路在调节细胞增殖、胚胎发育和肿瘤的发生发展方面起着重要的生物学作用(Logan and Nusse，2004;Clevers and Nusse，2012)

棉铃虫Helioverpa armigera 是一种世界性的农业害虫，其危害的经济作物较多，每年给全球农业造成很大的经济损失。棉铃虫以多种方式适应外界恶劣的环境条件，滞育是其中一种重要的方式(徐卫华，2008)。滞育是指昆虫发育的停滞，其重要的特征是发育缓慢、代谢速率下降以及抗逆性增强(Denlinger，2002)。滞育并非发育的完全停止，而是另外一种特殊的发育状态，滞育过程中部分基因的表达下降，也有部分基因的表达上升(Lu and Xu，2010;Bao and Xu，2011)。对棉铃虫滞育进行研究，有较大的理论意义和应用价值。棉铃虫滞育的激素调节已经研究得比较透彻，但从分子水平阐述滞育机制的研究较少(朱佳等，2010)。鉴于Wnt/β-catenin 信号通路在发育中的重要作用，我们通过克隆β-catenin 基因并比较分析滞育和非滞育蛹脑中β-catenin 基因的表达水平变化，试图窥探Wnt/β-catenin 信号通路是否在棉铃虫滞育过程中起作用。

本研究首先运用 RACE 技术(rapid-amplification of cDNA ends)首次克隆了棉铃虫的β-catenin 基因，分析了其在滞育和发育蛹脑的差异表达情况，并构建真核表达质粒，为进一步研究Wnt/β-catenin 信号通路在棉铃虫发育过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验昆虫

棉铃虫为本课题组所饲养，品系由南京农业大学苏建亚教授提供，原产河南省。保种用的棉铃虫一直在25oC，14L∶10D(光照:黑暗)的条件下饲养。滞育型棉铃虫的1-3 龄幼虫在25oC 条件下培养，光照条件设定为14L∶10D;生长到3 龄末期，将其转移到20oC 恒温培养箱，光照条件为10L∶14D。非滞育型棉铃虫的饲养过程与滞育型相同，差别在于其光照条件一直保持在光照14 h。

1.2 菌株、载体、细胞和试剂

大肠杆菌DH5α、昆虫表达载体pIZ/v5-GFP、美洲棉铃虫Helioverpa zea 的卵巢细胞HzAm1均为本实验室保存;pMD18-T 载体、Taq DNA polymerase 及限制性核酸内切酶购自Takara 公司;RACE 试剂盒购自Clontech 公司;M-MLV 反转录试剂盒购自Promega 公司;Trizol ® Reagent 购自Invitrogen 公司;质粒DNA 小量提取试剂盒、DNA产物纯化试剂盒购自爱思进生物技术有限公司;蛋白Marker、HRP 偶联的羊抗兔二抗以及Western blot 所用发光液均购自Thermo 公司。其它试剂均为分析纯(A.R.)。

1.3 引物设计和合成

本研究所用的引物，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。具体序列及说明见表1。设计简并引物时，参考已报道的棉铃虫近缘物种序列，如家蚕Bombyx mori，帝王蝶Danaua plexippus 和烟草天蛾Manduca sexta，找到保守的DNA 序列，以此设计简并引物。原则是尽量选用包含简并碱基少的序列，引物长度为16-18 碱基。

1.4 总RNA 的提取及cDNA 第一链的合成

按照试剂盒提供的方法，取一定量的组织，加入1 mL Trizol 进行匀浆，提取总RNA。取1 μg RNA 进行逆转录，合成第一链cDNA。

1.5 RACE

按照试剂盒提供的说明，使用特定的接头作为反转录引物，取1 μg RNA 为模板，分别合成5'-RACE-Ready cDNA 和3'-RACE-Ready cDNA。用基因特异性引物和试剂盒提供的UPM 引物进行第一轮PCR 扩增;扩增产物稀释后作为模板，以基因特异性引物和试剂盒提供的NUP 引物进行第二轮PCR 扩增。扩增后的片段与pMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确后测序分析。

1.6 序列分析

利用 DNAStar 对序列进行分析和预测β-catenin 的ORF(开放阅读框)。用MEGA 6.06软件进行遗传距离分析，并用Maximum liklihood法构建系统进化树。

1.7 棉铃虫蛹脑中β-catenin 的表达分析

取15个蛹脑，按照1.4 的方法合成第一链cDNA，PCR 检测β-catenin 的表达情况，以RpL32 作为内参对照。

1.8 真核表达载体的构建

设计引物，正向引物带BamHI 酶切位点，反向引物带XbaI 酶切位点，PCR 扩增β-catenin 编码区全长。用BamHI 和XbaI 对扩增产物进行双酶切后，与同样双酶切的pIZ/v5-GFP 载体进行连接。转化大肠杆菌DH5α，鉴定后进行测序确认。

1.9 细胞培养、转染及细胞定位研究

HzAm1 是一种半贴壁细胞，培养所需的培养基为含10%胎牛血清的Grace's 昆虫培养基。在不含CO2的27℃细胞培养箱中进行培养。24 孔板中细胞密度约90%时进行转染，48 h 后按1∶1000 的比例加入5 mg/mL Hoechst 33342 染料，染核10 min后在倒置荧光显微镜下观察融合蛋白的表达情况，根据细胞核的位置判断目的蛋白的亚细胞定位。

1.10 Western blot 检测

转染48 h 后，提取蛋白，用Bradford 法测定蛋白浓度。取10 μg 蛋白上样电泳，100 v 转膜1 h。5% 脱脂牛奶室温封闭1 h 后分别用V5 标签抗体(1∶5000)和二抗(1∶3000)进行孵育，最后进行曝光显影。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

2 结果与分析

2.1 棉铃虫β-catenin 基因的克隆与氨基酸序列分析

根据近缘物种的β-catenin 基因序列，设计了两对简并引物。利用巢式PCR 的方法，扩增出了一条约700 bp 的条带，大小与预期相符(图1A)。对该片段测序分析，发现其与近缘物种的相似度较高。根据测定的序列设计基因特异性引物，进行3'-Race 和5'-Race，分别获得了1611 bp和942 bp 的条带(图1B 和1C)。测序后进行拼接，获得了棉铃虫β-catenin 基因的全长cDNA 序列，命名为Har-β-catenin(Genbank 登录号为KJ206237)。

Har-β-catenin 全长2682 bp，其中开放阅读框2382 bp，编码一个793 aa 的蛋白质，预测其分子量为86.7 kDa(图2)。已报道的β-catenin 蛋白的一个共同特征是具有多个ARM 重复结构域(Armadillo/β-Catenin-like repeats)，将预测的棉铃虫β-catenin 蛋白质序列提交在线蛋白质分析工具ExPASy(http://prosite.expasy.org/)进行分析，结果也找到了多个ARM 重复结构域(图2)，这说明β-catenin 蛋白是一个在生物进化上非常保守的蛋白质。

图1 Har-β-catenin 基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1 Analysis of PCR products of Har-β-catenin by agarose gel electrophoresis

图2 Har-β-catenin cDNA 序列及推测的氨基酸序列Fig.2 cDNA and the duduced amino acid sequences of Har-β-catenin

2.2 棉铃虫β-catenin 与其它昆虫β-catenin 的系统进化分析

运用MEGA 6.06 软件对棉铃虫和其它已报道的部分昆虫β-catenin 进行系统进化树的分析，结果表明棉铃虫首先与家蚕聚到一起，然后与帝王蝶聚为一支。该支与蝇科的果蝇和家蝇、实蝇科的地中海实蝇Ceratitis capitata、蚊科的埃及伊蚊Aedes aegypti 和致倦库蚊Culex quinquefasciatus 有较近缘的关系，最后聚为一大支(见图3)。

2.3 Har-β-catenin 在滞育和发育蛹脑中的表达变化

选取化蛹后0、5、10 和15 d 的棉铃虫，利用RT-PCR 检测Har-β-catenin 基因在棉铃虫滞育蛹脑和非滞育蛹脑中的差异表达情况，RpL32 基因作为内参对照。结果表明，Har-β-catenin 在两种发育状态的蛹脑中均有表达。如图4B 所示，非滞育蛹脑中Har-β-catenin 的表达量较高，且随着发育的进行表达量逐步上升，而滞育蛹脑中的表达较低。

图3 Har-β-catenin 与其它昆虫β-catenin 的系统进化树Fig.3 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences of Har-β-catenin protein

图4 Har-β-catenin 在棉铃虫蛹脑中的表达变化Fig.4 Expression pattern of Har-β-catenin in brains of Helicoverpa armigera

2.4 Har-β-catenin 真核表达质粒的构建及亚细胞定位研究

为了进一步研究棉铃虫β-catenin 基因的功能，构建了Har-β-catenin 的真核表达载体。验证正确的质粒转化棉铃虫HzAm1 细胞，用识别载体本身表达的V5 序列的标签抗体进行Western blot发现，在稍小于140 kDa 处有一条特异的条带，与预期大小一致(Har-β-catenin 86.7 kDa，载体本身表达的GFP 和V5 约35 kDa)，说明构建的载体可以在HzAm1 细胞中正确表达。亚细胞定位实验如图5B 所示，Har-β-catenin 主要在细胞质中表达，预示着正常培养的棉铃虫细胞Wnt/β-catenin 信号通路未被激活。

图5 Har-β-catenin 真核表达及亚细胞定位研究Fig.5 Eukaryotic expression and subcellular localization of Har-β-catenin

3 结论与讨论

β-catenin 在进化上高度保守，它是一个多功能蛋白，通过形成不同的蛋白复合物而参与调节不同的生理功能(Damalas et al.，1999)。在细胞中，β-catenin 主要参与形成两个重要的蛋白复合物(Kimelman and Xu，2006):①β-catenin 作为细胞骨架蛋白，通过α-catenin 在细胞膜处与E-cadherin(上皮细胞钙粘蛋白)形成复合物(Jou et al.，1995)。该复合物介导同质细胞间的粘附，在抑制肿瘤侵袭、防治细胞的移动等方面发挥重要的生理功能(王启明等，2006)。②β-catenin同时也是Wnt/β-catenin 信号通路中的至关重要的组分，通过与TCF/LEF 转录因子结合从而激活下游一系列靶标基因，如c-myc 和cyclin D1 等的转录。

Wnt/β-catenin 通路的框架的建立主要是源于对果蝇的研究。1991年Peifer 等人发现果蝇的armadillo 基因(β-catenin 同源基因)在Wnt/β-catenin 信号通路中起调节作用(Peifer et al.，1991)。之后该通路的其它成员也逐步被鉴定出来。目前，除了在模式生物果蝇中的研究，家蚕中β-catenin 的表达及作用也有一些报道(Dhawan and Gopinathan，2004)，而其它昆虫中β-catenin的研究很少。

本研究通过分析已知的棉铃虫近缘物种β-catenin 基因的序列，设计简并引物扩增棉铃虫β-catenin 基因的中间片段，然后通过RACE 技术得到了棉铃虫β-catenin 基因的cDNA 序列。对其推导的氨基酸序列提交ExPASy 网站进行分析，发现其具有多个ARM 重复结构域。ARM 重复结构域是由约42个氨基酸组成的，一般认为该结构域作为分子适配器，协调β-catenin 蛋白之间的作用(Peifer，1995)。已报道的β-catenin 蛋白都含有多个串联的ARM 重复结构域，如人的β-catenin蛋白大小为92 kDa，含有13个ARM 重复结构域(Ilyas et al.，1997)。

克隆棉铃虫β-catenin 基因的cDNA 序列后，通过RT-PCR 的方法比较了滞育和非滞育蛹脑中β-catenin 基因的表达情况，结果表明滞育蛹脑中β-catenin 的表达水平明显低于非滞育蛹脑。这预示着非滞育蛹脑，也就是正常发育的棉铃虫蛹脑中Wnt/β-catenin 信号通路活性有可能要强于滞育蛹脑。换一句话说，有可能滞育蛹脑中Wnt/β-catenin 信号下调，从而使棉铃虫的发育受到抑制。当然，还需要进一步的证据才能确定该推论，因为β-catenin 除了在Wnt/β-catenin 信号通路中起作用外，还是细胞骨架的组成成分。在后续研究中，尚需作进一步的研究来调查棉铃虫滞育和非滞育蛹脑中Wnt/β-catenin 信号通路的活性，以确定该通路在棉铃虫滞育中的作用。

综上所述，本研究所取得的这些阶段性成果，为后续深入研究Wnt/β-catenin 信号通路在棉铃虫滞育中的作用奠定了一定的基础。

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