甲磺酸伊马替尼对高氧暴露新生大鼠肺保护作用及其机制

沙宁，田兆方，李玉红

(1南京医科大学附属淮安第一医院，江苏淮安223300;2淮安市第二人民医院)

高氧肺损伤是危重症新生儿救治过程中的主要并发症，其常见形式是支气管肺发育不良(BPD)［1］。血小板源性生长因子B亚型(PDGF-B)与其受体结合后，可以刺激成纤维细胞产生胶原酶，造成间质胶原断裂及排列紊乱，引起肺组织纤维化，从而发生BPD［2，3］。研究证实，甲磺酸伊马替尼能够抑制血小板源性生长因子受体(PDGFR)的酪氨酸激酶和转化生长因子β(TGF-β)信号传导通路，从而抑制纤维化过程，在肺、骨髓等多种组织纤维化的治疗中具有较好疗效，但其对高氧所致肺损伤的影响鲜见报道［4，5］。2014 年11 月～2015 年3 月，我们对高氧暴露新生大鼠给予甲磺酸伊马替尼治疗，观察其肺保护作用，并探讨其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级新生SD大鼠24只，雌雄不限，体质量8.0～12.0 g，3日龄，均购自江苏省动物实验中心。甲磺酸伊马替尼购于诺华制药有限公司，PDGF试剂盒购自美国R＆D Systems公司，酶联免疫检测试剂盒购于上海盈公生物技术有限公司，GDS-8000型凝胶成像分析系统购于英国UVP公司。

1.2 造模与分组处理 将24只新生大鼠随机分为正常对照组、高氧对照组和伊马替尼组各8只。正常对照组暴露于正常室内空气中(FiO2:21%)，高氧对照组、伊马替尼组暴露于高浓度氧气中(FiO2:95%，温度23～25℃);伊马替尼组高氧暴露的同时腹腔内注射甲磺酸伊马替尼50 mg/(kg·d)，正常对照组、高氧对照组同时注射等量生理盐水，共7天。各组母鼠每24 h互换，避免母鼠氧中毒影响新生鼠哺乳。

1.3 血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)PDGF-B检测 各组均于造模10天腹腔注射10%水合氯醛8 mL/kg，采用眼眶取血法收集血液2 mL，1 500 r/min离心10 min，取血清。切断腹主动脉后放血处死大鼠，颈正中暴露气管;剪开一小口插入导管并固定，向导管内缓缓注入1 mL冷生理盐水，反复回抽3次，收集BALF约0.8 mL。采用ELISA法检测各组血清及BALF中PDGF-B水平，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 肺组织病理学观察及肺损伤评分 各组收集BALF后，快速剪开胸腔，取出双侧肺脏。生理盐水反复冲洗。右肺组织以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片。切片行HE染色，200倍光镜下观察肺组织形态学改变。同时参照田兆方等［6］的方法，从肺泡间隔水肿、肺泡出血、肺泡内纤维蛋白沉积、肺泡内细胞浸润4个方面对肺损伤进行评分。

1.5 肺组织PDGF-B mRNA检测 采用RT-PCR法。取大鼠左下肺组织，TRIzol试剂提取总RNA，计算RNA浓度后逆转录合成cDNA。PDGF-B上游引物 5'-TCTGCTGCTACCTGCGTCTG-3'，下游引物5'-GCGTTGGTGCGGTCTATGA-3'，引物长度316 bp;以GAPDH为内参，上游引物5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3'，下游引物5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'，引物长度540 bp。PCR反应体系:RT 产物 2.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 2 μL，dNTPS(10 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，镁离子4 μL。PCR 反应条件:95 ℃预变性 5 min，56.3 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环;最后72℃延伸10 min。将所得产物经琼脂糖凝胶电泳，采用GDS-8000型凝胶成像分析分析软件检测其灰度值，PDGF-B mRNA相对表达以目的基因与内参基因灰度值的比值来表示。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清及BALF中PDGF-B水平比较 见表1。

表1 各组血清及BALF中PDGF-B水平比较(±s)

表1 各组血清及BALF中PDGF-B水平比较(±s)

注:与正常对照组比较，*P＜0.05;与高氧对照组比较，#P均＜0.01。

组别 n PDGF-B(pg/mL)BALF正常对照组血清0.462 0.000 8 0.71 ±0.19 66.15 ±3.99高氧对照组 8 0.86 ±0.29 103.91 ±6.79*伊马替尼组 8 0.81 ±0.23 85.08 ±6.33*#P

2.2 各组肺组织病理观察 正常对照组肺组织形态正常，肺泡结构清晰。高氧对照组、伊马替尼组肺泡壁明显水肿、增厚，肺间质中性粒细胞浸润明显，出现轻、中度肺出血、肺水肿，肺泡充满各种白细胞、纤维素，且高氧对照组上述变化更明显。

2.3 各组肺损伤评分比较 正常对照组、高氧对照组和伊马替尼组肺损伤评分分别为(0.62±0.21)、(2.32 ±0.38)、(1.61 ±0.46)分。组间两两比较，P均 ＜0.05。

2.4 各组肺组织PDGF-B mRNA表达比较 正常对照组、高氧对照组和伊马替尼组PDGF-B mRNA相对表达量分别为 0.26 ±0.04、0.44 ±0.09、0.32±0.03。组间两两比较，P 均 ＜0.05。

3 讨论

随着肺表面活性物质替代治疗及机械通气方式的改进，近年来早产儿生存率明显升高，但BPD的发病率也逐年增加［7，8］。BPD 的发病机制极其复杂，其本质是各种环境因素导致发育不成熟肺损伤及损伤后肺组织的异常修复［9］。当未成熟肺暴露于高氧状态下，产生大量氧自由基，超过机体消除能力，表现为进行性肺损伤［10］。高氧肺损伤是组织弥散性肺泡炎和损伤后修复重建的病理生理过程，早期特征性改变是肺泡炎性水肿，继而出现肺间质增生和肺纤维化［11］。2～3日龄新生大鼠的肺脏发育处于囊泡期，肺发育尚未完善，塑形及重塑均较活跃，相当于人类胎龄28周左右的肺发育结构，由于肺泡发育不成熟，高氧更易对其产生损伤。本研究采用高氧诱导新生大鼠BPD模型，在病理过程及病理变化上符合早产儿BPD的发生、发展过程。

PDGF是刺激成纤维细胞分裂、增殖的重要因子。近年研究发现，PDGF在正常胎肺发育过程中存在动态变化。PDGF与PDGFR在肺发育过程中起介导整个肺器官生长的作用，其动态变化与肺发育阶段有关，主要影响上皮细胞的生长、分化，也与呼吸道上皮出现或控制肺血管形成有关［12］。甲磺酸伊马替尼是一种PDGFR酪氨酸激酶抑制剂，能抑制PDGFR的酪氨酸激酶和TGF-β信号传导通路上的 c-ABL，从而抑制纤维化过程［13，14］。

本研究结果表明，在高氧暴露下，肺组织损伤评分增加，提示高氧对肺组织有损伤;PDGF-B及PDGF-B mRNA表达明显增多，提示PDGF-B可能是介导高氧肺损伤的机制之一，这与严青然等［15］报道一致。本研究结果还显示，与高氧对照组比较，伊马替尼组肺出血、肺水肿不明显，肺泡白细胞、纤维素减少，肺组织损伤评分显著降低，提示甲磺酸伊马替尼对肺组织有保护作用。而PDGF-B及PDGF-B mRNA表达明显减少，提示甲磺酸伊马替尼可能通过PDGF及其受体轴对高氧诱导的新生大鼠肺损伤产生保护作用。本研究中各组血清PDGF-B水平比较无统计学差异，提示甲磺酸伊马替尼的这种保护作用直接作用于肺部。鉴于新生动物肺组织的特殊性，有关甲磺酸伊马替尼保护高氧所致肺损伤的确切机制仍需进一步研究。

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