拉帕替尼联合顺铂对人食管癌细胞株Eca-109增殖的抑制作用

陈逢生，陈晓华，曹小龙，邬要芬，张晓娜，李黎波，罗荣城

(1南方医科大学中西医结合医院，广州510315;2广州市番禺中心医院)

拉帕替尼为表皮生长因子(EGFR)和2型人表皮受体(HER2)的细胞内酪氨酸激酶区域的靶向型激酶抑制剂，可阻断EGFR和HER2下游区发信号途径，从而抑制受体自磷酸化作用［1～5］。目前，尚无拉帕替尼用于食管癌临床的报道，但其对食管癌细胞增殖有显著的抑制作用［6］。顺铂为周期非特异性化疗药，已广泛用于食管癌治疗［7，8］。但是，拉帕替尼与顺铂联合是否存在协同效应，则需进一步研究。2013年9月～2014年9月，我们通过分析不同浓度的拉帕替尼及顺铂对人食管癌细胞株Eca109的增殖抑制作用，并明确两者是否对Eca109存在协同效应。

1 材料与方法

1.1 材料 Eca-109购自中科院细胞库。RPMI-1640培养基(Gibco公司)，小牛血清(兰州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(上海化学试剂公司)，EDTA(汕头光华化学厂)，CO2培养箱(Heraeus公司)，超净工作台(苏州净化仪器厂)，台式低温高速离心机(Thermo公司)，拉帕替尼(葛兰素史克)，顺铂(江苏豪森)，倒置相差显微镜(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组处理 培养条件:RPMI-1640培养基，10%小牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，置于 37℃、5%CO2恒温孵育箱。当对数生长期细胞长满培养瓶80%左右时，0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 消化 30～60 s，镜下观察细胞大部分变形后弃消化液;加入RPMI-1640培养液，吹打;1 500 r/min离心5 min，去上清;加入全培养基，调整细胞浓度为1×104/mL;接种于96孔培养板，每孔100 μL，置于37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h。将细胞分为4组，每组每浓度4个复孔。A组只加入培养液200 μL;B组(拉帕替尼)、C组(顺铂)加入不同药物浓度的培养液200 μL，使拉帕替尼终浓度分别为 0.05、0.5、1、2.5、5、12.5、25 μmol/L，顺铂终浓度分别为 0.5、1、2、4、8、16、32 μg/L;D组(拉帕替尼联合顺铂)分别为0.05 μmol/L+0.5 μg/L、0.5 μmol/L+1 μg/L、1 μmol/L+2 μg/L、2.5 μmol/L+4 μg/L、5 μmol/L+8 μg/L、12.5 μmol/L+16 μg/L、25 μmol/L+32 μg/L。继续培养24 h。

1.2.2 细胞抑制率检测 采用MTT法。每孔加入MTT 20 μL，避光培养4 h后去培养液，每孔加入DMSO 150 μL。于振荡器上摇匀后酶标仪测 OD值，计算细胞抑制率。细胞抑制率=1-(实验组OD-本底组OD)/(空白对照组OD-本底组)。实验重复3次。

1.2.3 联用效果判断 采用协同作用q值判断拉帕替尼与顺铂联用的效果。q=EAB/(EA+EB-EA×EB)。式中EA和EB为各药单用抑制率，EAB为合用抑制率。q≥1.15为协同作用，0.85～1.15为相加作用，＜0.85为拮抗作用。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞抑制率比较 见表1。

表1 各组细胞抑制率比较(%，±s)

表1 各组细胞抑制率比较(%，±s)

注:1～7 分别对应拉帕替尼终浓度 0.05、0.5、1、2.5、5、12.5、25 μmol/L 和(或)顺铂终浓度 0.5、1、2、4、8、16、32 μg/L。

组别 1 2 3 4 5 6 7F P B 组 0.23 ±0.11 0.19 ±0.11 0.43 ±0.31 0.46 ±0.40 0.75 ±0.14 0.85 ±0.04 0.82 ±0.10 5.003 0.006 C 组 0.07 ±0.06 0.15 ±0.47 0.19 ±0.77 0.28 ±0.75 0.38 ±0.15 0.47 ±0.27 0.48 ±0.27 2.879 0.048 D 组 0.17 ±0.04 0.15 ±0.05 0.40 ±0.26 0.45 ±0.37 0.72 ±0.94 0.81 ±0.17 0.77 ±0.10 7.040 0.001

2.2 联用效果比较 D组拉帕替尼和顺铂浓度组合 0.05 μmol/L+0.5 μg/L、0.5 μmol/L+1 μg/L、1 μmol/L+2 μg/L、2.5 μmol/L+4 μg/L，q 分别为0.61、0.46、0.74、0.72;而当拉帕替尼和顺铂浓度组合 5 μmol/L+8 μg/L、12.5 μmol/L+16 μg/L、25 μmol/L+32 μg/L 时，q 分别为 0.85、0.86、0.85。

3 讨论

Guo等［6］研究发现，拉帕替尼及5-FU对食管癌细胞有显著增殖抑制作用，两者联合有协同作用。本研究发现，拉帕替尼、顺铂单药及联用均对Eca109有显著抑制作用，且随浓度增加加强。除了当拉帕替尼浓度达到一定程度时，其杀伤作用未见明显上升，我们推测可能与细胞内拉帕替尼达到饱和浓度有关。在我们实验的浓度范围内，拉帕替尼与顺铂联合并未出现协同作用，而当拉帕替尼和顺铂浓度组合 5 μmol/L+8 μg/L、12.5 μmol/L+16 μg/L、25 μmol/L+32 μg/L 时，两者联合为相加作用。其机制可能为拉帕替尼将细胞周期阻滞于G0/G期［6］，而顺铂属于细胞周期非特异性药物，对增殖细胞各期都有一定的影响。

本研究表明，在取得相同疗效的前提下，联合应用可以减少化疗药物的剂量，并进而可能减少其相应的不良反应。本研究为食管癌生物化疗模式提供一定的依据，但其具体作用机制及临床效应仍需进一步的研究及更多的临床循证医学证据。

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