肿瘤坏死因子α基因多态性与脓毒症易感性及感染程度的关系

田虹，魏殿军，何新飙

(天津医科大学第二医院，天津300211)

脓毒症是严重创(烧)伤、休克、感染、外科大手术后常见的并发症，是由于感染而导致的全身炎症反应综合征(SIRS)的临床表现，当并发1个及以上器官功能障碍时则称为严重脓毒症，是ICU患者最常见的死亡原因。脓毒症的发病机制十分复杂，是多基因参与的遗传因素和环境因素共同作用的结果。其中，肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种重要的炎症细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，具有免疫细胞调节功能;作为内源性致热源，可引发炎症、败血症等疾病，在脓毒症的病理生理过程中发挥着重要作用［1～4］。2009年10月～2010 年 9 月，我们从基因角度分析了TNF-α基因多态性与脓毒症易感性及感染程度的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集天津医科大学第二医院ICU收治的脓毒症患者80例，均符合2012年美国危重病协会的诊断标准［5］。其中，男48例、女32例，年龄(52.43±15.21)岁;原发病为重症肺炎35例，慢性支气管炎急性发作22例，泌尿系感染14例，腹腔感染5例，颅内感染3例，导管相关性感染1例;严重脓毒症患者32例(A组)，SIRS患者48例(B组)。A 组男20例、女12例，年龄 (54.00±16.22)岁，累及1个脏器19例、2个脏器7例、2个以上脏器6例;B组男 28例、女 20例，年龄为(51.38±14.58)岁。选择同期门诊体检健康者 50例(C组)，男28例、女 22例，年龄(47.84±14.44)岁。入选人群均为天津市常住汉族人口，各组年龄、性别构成具有可比性(P均＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 TNF-α基因多态性检测方法 采用聚合酶链反应—限制性片段多态性(PCR-RFLP)法。①基因组DNA提取:清晨空腹抽取静脉血2 mL，EDTAK2抗凝，用全血基因组提取试剂盒(离心柱型，北京天根生物技术公司)提取基因组DNA，-40℃冷冻保存备用。②PCR扩增:利用GenBank中基因序列，用DNA star软件设计引物，由华大基因公司合成。TNF-α基因308G/A上游引物为5＇-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3＇，下游引物为 5＇-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3＇;238G/A 上 游 引 物 为 5＇-AGAAGACCCCCCTCGGAACC-3＇，下游引物为 5＇-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3＇。PCR 反 应 体 系(25 μL):Premix Taq 酶 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，双蒸水 7.5 μL，DNA 3 μL。PCR 反应条件:TNF-α基因308G/A:95℃预变性2 min，95℃变性1 min，56 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸30 s，循环 35 次，72℃最终延伸10 min;238G/A:95℃预变性5 min，94℃变性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环35次，72℃最终延伸5 min。③琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物:称取1.5 g琼脂糖，加入100 mL 1×TBE，放入微波炉中加热至完全溶解;冷却至60℃左右加入5 mg/mL的溴化乙锭(EB)5 μL，混匀后倒入插好齿梳的灌胶槽中，厚度约5 mm。取5 μL PCR 扩增产物与 10 × Loading Buffer l μL 混匀，加样于含EB的2%琼脂糖凝胶板点样孔内;每块胶板中有1个点样孔加入DL 2000 DNA Marker 6 μL，电压100 V电泳40 min后置凝胶成像系统中下观察，摄影。TNF-α基因308G/A位点的扩增片段长度为107 bp，TNF-α基因238G/A位点的扩增片段长度为152 bp。④限制性酶切:采用限制性内切酶(308G/A位点用FastDigest NcoⅠ，238G/A位点用FastDigest MspⅠ)消化反应进行基因分型，总反应体系30 μL(双蒸水 17 μL，10 × FastDigest Buffer 2 μL，PCR 产物 10 μL，FastDigest enzyme 1 μL)，37℃水浴10 min。回收之后，2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

1.2.2 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增产物酶切后结果 TNF-α基因238G/A位点PCR扩增产物酶切后，电泳见132 bp 1条片段为GG基因型，152、132 bp 2条片段为GA基因型，152 bp 1条片段为AA基因型。结果见图1。TNF-α基因308G/A位点PCR扩增产物酶切后，电泳见87 bp 1条片段为GG基因型，107、87 bp 2条片段为GA基因型，107 bp 1条片段为AA基因型。结果见图2。

图1 TNF-α基因238G/A位点PCR扩增产物酶切后电泳结果

图2 TNF-α基因G/A308位点PCR扩增产物酶切后电泳结果

2.2 TNF-α 基因 238G/A、308G/A 位点基因型及等位基因分布 见表1、2。

3 讨论

表1 各组TNF-α基因238G/A位点基因型分布［例(%)］

表2 各组TNF-α基因308G/A位点基因型分布［例(%)］

随着国际人类基因组计划、单核苷酸多态性(SNP)计划和单倍型图谱(HapMap)计划的相继实施，遗传因素在感染性疾病发生、发展中作用备受关注［6］。基因多态性是决定人体对应激打击和感染的易感性与耐受性、临床表现多样性及药物治疗反应差异性的重要内在因素，对脓毒症炎症细胞因子的基因多态性进行深入研究，可能为脓毒症易感人群的早期识别［7］、预后分析、个体化免疫调控治疗和未来的基因治疗提供新的理论依据。在炎症早期，众多炎症介质大量释放，其中TNF-α扮演着重要角色［8，9］。TNF-α 的基因多态性主要出现在其启动子上游的一些区域［10～12］，与炎症相关的 SNP，目前主要集中在 1031C/T、863C/A、857C/T、308G/A、238G/A。研究发现，TNF-α启动子308位点和238位点的基因多态性与脓毒症的易感性和结局密切相关，但这方面的研究结论并不完全一致，仍有很大争议［13，14］。

本研究结果显示，TNF-α基因在238、308位点上，感染患者(脓毒症及SIRS患者)与健康人群的基因均存在多态性，但是TNF-α在238位点和308位点的基因多态性在健康人群和感染患者以及感染严重程度上均无明显相关性。TNF-α基因238、308这两个多态性位点在中国人群中属于高频SNP，在天津地区亦是如此。目前，对于TNF-α基因308位点的研究较多，但结论不一致;对于TNF-α基因在238位点的研究较少，特别是该位点与脓毒症关系的研究更少，缺乏经验。本研究TNF-α基因308位点的基因型和等位基因频率在感染患者与健康人群中无明显差异，同国内相关性的研究比较，天津地区健康汉族人群的TNF基因该位点的等位基因分布同中国其他地区的汉族人群相近［15］，差异不明显可能与地域不同有关。本研究首次证明了天津市汉族人群TNF-α在238位点的基因型和等位基因频率在感染患者与健康人群中无明显差异，说明本地区该位点的基因多态性与脓毒症及SIRS无明显相关性，可为今后的研究提供经验。可见，脓毒症是多基因相关的复杂临床综合征，在基因水平的深入研究，可为脓毒症患者提供个体化治疗方案，这是今后研究的热点。

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