梗阻性无精子症患者睾丸与附睾精子DNA完整性和顶体完整率、反应率对比分析

何泳志，李大文，成俊萍，万里凯，肖鑫，龚国通

(1广西壮族自治区人民医院，南宁530021;2广西中医药大学)

据WHO统计预测，不孕不育将成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病的第三大疾病［1］。在不孕不育原因中，男性因素约占40%。梗阻性无精子症(OA)是男性不育的常见原因，卵胞质内单精子注射(ICSI)是其常用的治疗措施。为获得更好的精子助孕，我们对比分析了OA患者睾丸与附睾精子DNA完整性、顶体完整率和反应率的差异。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 入选标准:①年龄20～40岁;②精液常规检查≥3次，离心后确认精子数为0;③性激素检查促卵泡激素(FSH)基本正常;④睾丸体积＞30 mL或单侧体积＞15 mL，睾丸活检存在精子;⑤排除其他原因导致的不育;⑥需行ICSI助孕者。选择2012年6月～2014年12月广西壮族自治区人民医院收治的符合入选标准的OA患者240例，其中经睾丸取精110例(A组)、附睾取精140例(B组)。A 组年龄(28.56 ±2.18)岁，睾丸体积(29.92±2.09)mL，血清睾酮(519.04 ±92.08)ng/dL、FSH(7.04 ±2.36)IU/L;B 组年龄(28.81 ±2.31)岁，睾丸体积(29.84 ±2.07)mL，血清睾酮(522.33 ±88.03)ng/dL、FSH(7.37 ±2.22)IU/L;两组临床资料具有可比性，P均＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 取精方法 A组行经皮睾丸精子抽吸术(TESA)。患者取仰卧位，常规消毒、铺巾。术者左手固定一侧睾丸，用1%利多卡因行精索阻滞，在穿刺点亦行局麻。术者右手握带侧孔的12号针经皮穿刺进入睾丸，由助手用60 mL注射器吸取精子洗涤液2 mL，接上针头后抽吸，直至吸出组织，移入含精子洗涤液的培养皿中。磨碎精曲小管，在倒置显微镜下观察精子。如找不到精子，可改变方向再次穿刺，甚至穿刺另一侧睾丸。B组行经皮附睾精子抽吸术(PESA)。术前准备及麻醉同 TESA。用5 mL注射器吸入少量培养液，直视下用4号半针头经皮穿刺附睾，负压抽吸至有淡黄浑浊液体抽出。如未见液体被抽出，可改变穿刺方向重复抽吸。将抽吸出的液体注入含精子洗涤液的培养皿，在倒置显微镜下寻找活动的成熟精子。若提取液中无精子或无活动精子，则行对侧附睾穿刺。若附睾穿刺无精子，考虑行TESA。

1.2.2 精子DNA完整性观察 采用精子染色质扩散试验［2］，进行瑞氏—姬姆萨染色。计数400个精子，普通显微镜下观察精子光晕大小。根据光晕与精子头部横径的比例，将精子粗分为大(＞2/3)、中(1/4～2/3)、小(≤1/4)光晕和无光晕4个等级。大光晕、中光晕表示精子DNA完整无碎片，小光晕、无光晕和退化精子表示精子DNA断裂为碎片。以精子DNA断裂指数(DFI)表示DNA完整性，DFI越大完整性越差。DFI=(小光晕精子+无光晕精子+退化精子)/精子总数×100%。

1.2.3 精子顶体完整率及反应率测定 以豌豆凝集素进行染色，用异硫氰酸荧光素进行标记，用450～490 nm激发光，于1 000倍油镜下观察涂片。精子顶体完整(AI)为精子头部一半以上荧光染色明亮且均匀;精子发生顶体反应(AR)为精子仅在赤道带出现荧光带，或者在顶体区根本没有荧光染色。每张图片精子计数200条，用血球分类计数器计数AI和AR的数目，计算2张重复涂片AI和AR所占比率。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组DFI、精子顶体完整率、反应率比较见表1。

表1 两组DFI、精子顶体完整率、反应率比较(%， ± s)

表1 两组DFI、精子顶体完整率、反应率比较(%， ± s)

注:与 B 组比较，*P ＜0.05。

组别 n DFI 精子顶体完整率 精子顶体反应率A 组 110 31.76 ±23.60 48.39 ±22.46*9.72 ±8.88 B组140 31.17 ±23.47 40.10 ±20.77 9.44 ±8.33

3 讨论

大量研究表明，精子DNA和染色质的损伤与男性不育和女性自然受孕率低明显关联［3，4］。DFI与ICSI助孕时继续妊娠率呈负相关，且高水平DFI与ICSI植入率明显相关［5］。但是，精子DNA区域损伤与受精率降低、植入失败、流产、婴儿出生缺陷的关系仍存在争议［6，7］。国外学者研究发现，在体外受精过程中，精子染色质只与胚胎质量有关，与受精率、妊娠率无关［8］。正常情况下，在核中的精子因有特殊结构DNA非常稳定。精子DNA损伤最重要的机制是不正常的染色质包装、活性氧和凋亡，外界环境因素包括阴囊温度过高、吸烟、生殖道感染等。本研究发现，两组DFI并无差异，提示取精部位不影响DNA完整性。其可能与以下原因有关:①精子发生经过在睾丸、附睾内一系列成熟和修饰过程，不同来源的精子在畸形率、DNA和染色体异常、成熟度和印记基因等方面差异较大。②精子在睾丸尚呈精原细胞状态，仍是未成熟精子，精子活力差甚至是不动精子;附睾中精子由于慢性炎症介质，梗阻淤积导致氧化应激损伤。因此，OA患者睾丸与附睾精子DNA完整性无显著差异。

精子顶体是高尔基体衍生而来的帽状细胞器，覆盖在精子核的前2/3区。在受精过程中发生顶体反应是一个基本步骤，顶体膜和细胞质膜混合形成的囊泡在细胞外释放顶体酶，顶体酶上覆在精子头部，使精子穿透卵母细胞进行受精［9～11］。睾丸精子已初步发育，并具功能活性的顶体蛋白酶，进入附睾后顶体蛋白酶逐渐发育至功能成熟，而曲细精管和附睾管内液体存在抑制酶活性物质［12］。Michailov等［13］研究发现，锌离子刺激精子获能和顶体反应是由表皮生长因子受体激活的，细胞外锌通过MAP1激酶通路调节细胞增殖;在一部分细胞可作为信号分子，通过其受体调节精子多个信号通路，使精子获能和发生顶体反应。因此，精子顶体反应率、顶体酶活力及精子膜功能完整性是评价精子功能的重要指标，且精子顶体完整率与顶体内酶的含量及活力明显相关。研究发现，行ICSI时发生顶体反应，精子植入率升高，且可能更有利于胚胎的质量［14］。本研究发现，睾丸与附睾精子行ICSI时顶体反应率无明显差异，提示取精部位不影响DNA顶体反应。其与以下原因有关:①OA患者无论睾丸或附睾精子，其整体精子功能质量均较差，包括精子活力、精子正常形态、DNA完整性等，导致精子结合卵透明带后，在卵透明带上发生顶体反应均受到影响。②睾丸及附睾精子顶体酶由于自身不稳定，发生自发顶体反应，导致两者所检测到的顶体反应率无显著差异。

有文献报道，精子顶体完整率与正常形态精子百分率、精子活率、精子活力均呈正相关［15］。有研究报道，在输精管梗阻时，梗阻下段附睾管腔内压力增高，精子成熟的局部微环境稳态受到破坏;进一步引起附睾蛋白P34h表达和转录障碍，导致其合成和分泌受阻，最终影响精子的成熟及功能的获得［16，17］。OA患者附睾精子中可观察到大量精子小头、小顶体、梨形头、锥形头以及尾部缺陷精子，精子头部大量空泡出现可能是精子在梗阻盲端淤积、降解所致。研究发现，OA患者附睾精子顶体PSA染色荧光染色不均匀，且形态学检测显示其附睾精子头部有大量空泡以及显着的精子形态异常［18］。本研究显示，睾丸精子顶体完整率高于附睾精子，差异有统计学意义。其可能原因:①OA多为炎性梗阻，常见的慢性附睾炎可导致附睾纤维化、功能丧失，长期梗阻淤积导致氧化应激损伤，有碍于附睾内精子成熟、发育［19］。②附睾内炎性物质、淤血及组织碎片等易导致精子损伤。由于OA患者睾丸精子顶体完整率优于附睾精子，所以行ICSI结局可能会优于附睾精子。

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