枣高效微嫁接体系的研究

刘晓光，彭艳芳，李洁，张隆

（1.河北民族师范学院生物系，河北承德067000

2.河北农业大学中国枣研究中心，河北保定071000 3.冀中能源井陉集团元氏矿业有限公司，河北石家庄050031）

枣高效微嫁接体系的研究

刘晓光1，2，彭艳芳1，李洁1，张隆3

（1.河北民族师范学院生物系，河北承德067000

2.河北农业大学中国枣研究中心，河北保定071000 3.冀中能源井陉集团元氏矿业有限公司，河北石家庄050031）

利用患枣疯病的婆枣组培苗做砧木，健康冬枣组培苗做接穗，进行微嫁接。试验采取加入植物生长素调节、暗培养、嫁接口处理的方法改善砧木的茎粗状况，结果表明暗培养可增加茎粗，增长节间，减少后期除萌，更适用于枣树微嫁接；而加入植物生长调节剂等方法基本无效。试验进行了“婆枣-冬枣”和“冬枣-冬枣”的不同嫁接组合处理，结果表明，嫁接亲和性是嫁接成活的因素之一。试验还对嫁接不同时间的砧穗生长情况进行了跟踪调查，植原体能够从砧木传导至接穗中。

枣疯病；微嫁接；嫁接亲和力；植原体

枣树（Ziziphus jujuba Mill.）原产我国，是我国第一大干果。枣树以其抗逆性强、早果速丰、管理容易、营养丰富、用途广泛以及可兼顾经济和生态效益等诸多优点，一直昌盛不衰。但是，枣产业的生存正面临枣疯病的毁灭性威胁。能否及时有效地控制枣疯病，已成为枣产业可持续发展的头号威胁。因此，急需进行抗枣疯病优良品种的选育，从根本上解决枣疯病的高传染性问题。

枣疯病由植原体引起，枣疯病病原只存在于枣树的韧皮部组织。到目前为止，植原体还不能在人工培养基上进行分离培养。因此，用一般的接种方法不能达到病原传导的目的。河北农业大学中国枣研究中心枣疯病研究课题组在田间嫁接发现，将健康的接穗嫁接在疯树上，接穗萌发后会表现出疯症，且用PCR技术检测，能够在接穗中检测到病原存在。但是，田间试验耗时费工，在组培条件下进行此项试验可大大缩短进程。本试验选取患枣疯病的婆枣和冬枣组培苗为砧木，以商品性状优良的健康冬枣组培苗为接穗，在组培条件下利用微嫁接技术，研究不同砧穗处理后的枣疯病病原传导情况，以期能为枣疯病抗病性的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

砧木：15号婆枣感染枣疯病的组培苗（标记为15），继代培养7年，仍保持疯症：丛生，腋芽萌发抽生扫帚状的疯枝，托叶刺为小叶状；冬枣感染枣疯病的组培苗（标记为DF），继代培养1年。

接穗：健康冬枣的组培苗（标记为D）。

所有组培苗材料均来自于河北农业大学中国枣研究中心。

1.2方法

1.2.1嫁接方法

采用劈接的嫁接方式，将砧木接口端的茎段切成碶形，把接穗接口端茎段的下端劈开，插入砧木，使砧木和接穗的形成层贴合，嫁接口外部绑缚铝箔，使之固定不滑动，随后将嫁接苗转入嫁接培养基上进行培养。如图1所示。

1.2.2培养条件

采用MS基本培养基，琼脂9g/L，蔗糖30g/L，不加入任何植物生长调节剂，保持嫁接苗生长环境的一致性。光照时间14h，培养温度28℃。

1.2.3砧木的处理

具有枣疯病典型特征的枣疯病病苗，丛生现象严重，腋芽萌发，节间短缩，茎呈“之”字型生长并且变得很细弱，给嫁接工作带来很大困难。为得到节间较长较粗的砧木，采取了如下措施：

（1）暗培养：将砧木病苗接入不加激素的MS培养基中，在暗中培养20d左右，

（2）加入不同的植物生长调节剂进行调节。

赵锦[1]的研究认为，添加一定量的生长素类物质（IBA、GA3或NAA）能从一定程度上逆转病情，但荧光显微检测结果显示激素转健苗中依然含有大量病原。在此基础上，为了使带病砧木原本细弱的茎变得粗壮而更利于嫁接，使用了NAA，IBA和GA33种植物生长调节剂进行调节，具体使用浓度见下表。

图1　微嫁接示意图Fig1The procedure of micrograft

表1　调节砧木茎粗所使用的植物生长调节剂Table 1Plant growth regulators used for adjusting stem diameter

1.2.4不同嫁接组合的处理

（1）15做砧木，D做接穗，劈接，砧穗不加任何处理，标记为D/15。

（2）DF做砧木，D做接穗，劈接，砧穗不加任何处理，标记为D/DF。

分别在嫁接8d，13d，18d，23d，28d时调查两种嫁接组合接穗的成活数量。每个处理选择45棵嫁接苗，以接穗腋芽萌发作为接穗成活的标准，重复3次，取均值作为各个处理的嫁接成活率。

1.2.5嫁接口处理

根据秦子禹[2]的研究，枣微嫁接时，砧木和接穗用0.5 mg/L GA3浸泡处理后再嫁接的成活率显著比浸泡法和混培法高。因此，本试验也采用0.5 mg/L GA3浸泡处理砧木和接穗，同时以没有经过任何处理的砧木和接穗嫁接为对照，比较二者不同。

（1）0.5 mg/L GA3浸泡处理好的15、DF及D。

（2）直接嫁接，不经过任何溶液浸泡。

分别在嫁接8d，13d，18d，23d，28d时，调查以上两种处理方式下两种嫁接组合的接穗成活数量。每个处理选择45棵嫁接苗，以接穗腋芽萌发作为接穗成活的标准，重复3次，取均值作为各个处理的嫁接成活率。

2　结果与分析

2.1带枣疯病砧木组培苗节间和茎粗的调节

2.1.1暗培养的影响

将15号枣疯病病苗在黑暗中培养20d左右，砧木腋芽与腋芽的节间变得长且粗，只在下部的腋芽处有细枝萌发。但是病苗全部黄化，茎的含水量很高，用手术刀切时能发出明显的“嚓”声；用镊子夹时，稍用力就会将其夹断。经过暗培养处理后的砧木用于嫁接时，操作方便，后期不用除萌，且将嫁接苗置于光照下培养时，砧木渐渐恢复绿色，木质化程度增加，能够支撑接穗不至于倒伏。

2.1.2不同生长调节剂对茎粗的影响

枣疯病病苗的茎细而弱，用其做砧木操作不便。在不改变砧木内病原数量的前提下，使之茎粗加粗，节间增长，有利于嫁接操作。参照赵锦的方法，本试验采用了NAA，BA和GA3三种激素调节15号砧木茎粗。经过30d的培养，测定砧木的茎粗，结果如表2，

表2　不同生长调节剂对砧木茎粗的影响Table 2Effect of different hormones on the diameter of rootstocks

从表2可以看出，经过一次继代培养，砧木病苗与对照（不添加任何激素）的砧木病苗在茎粗上并没有出现太大的变化，差异不显著。虽然赵锦指出，在添加了生长调节剂的培养基中继代培养2～3代，疯苗会表现出转健的现象，即：茎增粗，节间变长，但是所需的培养时间较长。而且，试验中发现，随着操作熟练称度的提高，使用不添加激素的MS培养基继代培育的砧木，嫁接苗的成活率也可以满足试验需要。所以，后续试验仍采用不添加激素的培养基进行嫁接砧木的继代。

2.2GA3浸泡处理嫁接口对嫁接成活的影响

采用0.5 mg/L GA3浸泡处理15号砧木和冬枣接穗，同时以没有经过任何处理的砧木和接穗嫁接为对照，40d后统计两种不同处理的成活率及接穗萌发的时间（萌芽时间以超过一半的嫁接苗萌芽计算）。

表3　嫁接口不同处理对嫁接成活的影响Table3 Effect of treated with GA3

使用GA3浸泡砧木和接穗，比直接嫁接的成活率高，接穗萌芽的时间也较早。但是，经差异分析显示，两个处理的嫁接成活率差异不显著。

2.3不同嫁接组合的嫁接成活率

试验采取了两种不同的嫁接组合，即D/15和D /DF。以5级疯的组培苗做砧木，健康的冬枣组培苗做接穗，采用劈接的方式，在试管内进行微嫁接技术，使用铝箔绑缚，嫁接苗的伤口愈合良好，植株成活率高。

分别在嫁接8d，13d，18d，23d，28d时测定这两种嫁接组合的嫁接成活率。

表4　不同嫁接组合的嫁接成活率Table 4The rates of survived in two grafting combinations

从表4可以看出，随着培养时间的延长，两种嫁接组合嫁接苗的成活率也增加，在28d的时候分别达到77.78%和91.11%。并且，在各个阶段，D/DF组合的成活率都高于D/15。试验中观察发现，随着时间的延长，大约在40d左右，嫁接苗的成活率能达到95%以上。少量不能成活的原因，一方面可能是由于在操作过程中不注意而染菌，二是由于接口处太干燥而导致接穗萎蔫。D/DF组合的萌芽时间约为7天，比D/15稍提前。

试验表明，D/15在嫁接后28天，接穗均未表现出疯症；第32天才表现出疯症，即各腋芽萌发，托叶刺变成小叶状，整个接穗呈现枣疯病的典型症状；而D/DF在第28天时，63棵中就有14棵接穗萌发后表现出了典型症状，49棵表现正常。

从表4可以看出，D/DF的嫁接组合每个处理的嫁接成活率都要高于组合15/D，并且出现病症的时间早，表现出病症的嫁接苗数多。这可以从嫁接亲和性的角度来解释，即同品种内（D/DF）的嫁接亲和性要明显高于不同品种间（D/15）。

2.5不同嫁接时间砧穗的表现

嫁接6天后，调查30株嫁接苗，其中未愈合的24株，稍愈合的嫁接苗有6株（未愈合指砧木与接穗没有接合，一触即分离；稍愈合指砧木接穗切口连接处较紧密，向相反方向拉伸砧木和接穗时稍有阻滞感，但仍能将二者分离）。所有的嫁接苗的砧木及接穗都保持绿色，嫁接口处没有愈伤形成，接穗的腋芽都还未萌发，接穗未见干枯、萎蔫、失水及死亡等现象。

嫁接7天后，30株嫁接苗中，稍愈合的有13株，其中愈合的有6株。愈合的6株中，腋芽膨大，有萌发迹象的5株。

嫁接8天后，30株嫁接苗中，腋芽萌发的有4株，以此（接穗萌发）确认为嫁接成活的标准。大部分嫁接苗都已经处于稍愈合的状态，多于一半的接穗腋芽膨大。切口处形成肉眼可辨的白色愈伤，但量较小。打开绑缚的铝箔观察时，凡是愈合较快的嫁接苗嫁接口处稍干燥，湿度较小。嫁接口处湿度大的砧木和接穗没有结合在一起；湿度过小，砧木和接穗的切口处萎蔫失水，颜色变暗，砧木和接穗没有愈合迹象。

随着嫁接后时间的延长，嫁接苗的成活率也逐渐升高。刚萌发的新梢不表现枣疯病症状，D/15的组合在嫁接后第32天时，首次发现了新梢变疯，而D/DF的处理在嫁接后第28天即可发现新梢变疯。

3　讨论

图3　嫁接苗生长变化Fig 3Growth of the grafted plantlets

枣树的微嫁接已经有前人进行过类似研究。但是其研究内容相对复杂，所用步骤繁琐。微嫁接体系的建立不仅需要更高的嫁接成活率，而且是要为进一步进行其他研究奠定基础。因此，微嫁接体系应该是简单高效的。本试验对几个可能影响微嫁接的因子进行了研究，研究发现，微嫁接过程中亦体现了果树嫁接中的嫁接亲和性问题，这与传统经验是一致的。赵锦[1]认为添加激素能有效的增加茎粗，但是需要将砧木连续继代3-4次才能达到效果，每次处理的时间约为30天左右，前处理的时间较长，而本试验研究发现，使用植物生长调节剂进行砧木的处理并不能有效的增加茎粗，而将砧木进行暗培养一次，约10-20天即可使其节间伸长，相同长度的腋芽较少，简化了前处理的培养时间和处理手段，并可以减轻后期除萌的工作量。秦子禹[2]对枣微嫁接的影响因素进行了研究，使用了很多方法如伤口滴加植物生长调节剂、使砧木生根、调节培养温湿度等来提高嫁接成活率，但所用方法复杂、难以掌控，染菌几率较大，费事费力，不符合进一步研究的要求。另外，本试验还对嫁接后砧穗的表现进行了跟踪调查，其不同嫁接时间的愈合状况，为更完善的建枣微嫁接体系提供了可借鉴的基础资料。同时，试验结果证明，利用微嫁接技术可以使砧木中的植原体传导至接穗中，嫁接亲和力高的组合病原传导时间短于嫁接亲和力低的组合。

[1]赵锦,代丽,薛陈心,等.离体条件下进行治疗枣疯病药物筛选的可行性研究[J].河北农业大学学报,2006，(1)：70-73.

[2]秦子禹.枣试管微嫁接技术研究[D].保定：河北农业大学，2006.

The Efficient Micro-grafting of Ziziphus Jujube Mill.

LIU Xiao-guang1,2,PENG Yan-fang1,LI Jie1,ZHANG Long3
(1.Biology Department of Hebei Nomal University for Nationalties,Chengde，Hebei 067000,China 2.Chinese Jujube Research Center of the University of Agriculture of Hebei,Baoding，Hebei 071000,China 3.The Limited Company of Yuanshi Colliery of Jizhong Energy Resources Company, Shijiazhuang,Hebei 050031,China)

In this research,'Pozao'(PF)plantlets infected with JWB as rootstock and healthy Dongzao(DF)as scion are used in the micro grafting.The experiment tries employing auxin regulation,darkness and the grafting methods to improve the situation of the stem thickness.The results show that darkness can increase the stem diameter and internode and reduce the effort in removing the unwanted sprouts afterwards,while other methods like adding auxin regulation are proved mostly ineffective.Two combinations of scion-rootstock,healthy'Dongzao' grafted on diseased"Pozao"(marked D/PF)and healthy"Dongzao"grafted on diseased'Dongzao'(marked D/DF), are compared.The result indicates that genetic relationship has some effect on micro grafting.The rootstocks and scions were observed day by day,and it is found that the JWB phytoplasma was successfully transmitted into the scion from the diseased rootstock.

jujube witches'broom(JWB);micro grafting;grafting affinity;phytoplasma

Q94

A

2095-3763（2015）02-0034-05

2014-10-12

刘晓光（1980-），女，河北石家庄人，河北民族师范学院讲师，博士，研究方向为野生植物资源与利用。