酶抑制率法在蔬菜农残检测中的应用

王柱宽

（河北省唐山市玉田县农牧局，玉田064100）

近年，蔬菜的农药残留问题成为大家关注的焦点问题，农药残留检测工作在蔬菜生产基地、蔬菜批发市场、大型超市普遍开展，而应用最普遍的检测手段是农残的快速检测。酶抑制法因其较高的专一性、灵敏性、准确性及低成本等优点，在农残快速检测中被广泛应用。但在实际操作过程中，由于多种因素影响，会出现各种各样的问题，有时检测数据为零或抑制率超过100%，造成结果的误判或根本无法判定。下面就酶抑制法农残速测技术的原理、操作方法及实际操作中应注意的问题做一介绍。

1 原理

酶抑制率法主要用于检测农产品中有机磷类及氨基甲酸酯类两类农药的残留情况。其原理是：在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度称呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物(乙酰胆碱)水解，其水解产物与显色剂反应产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留。结果判定以酶的被抑制程度 （抑制率）表示。

2 机型选择

酶抑制率法农残检测仪厂家，根据单批次同时检测样品数量的不同，设计出不同的通道类型，常用的有8通道、12通道、24通道、48通道、96通道等。8通道可以同时检测1～7个样品，12通道可以同时检测1～12个样品，96通道可以同时检测最多92个样品，其他通道检测仪可以同时检测相应的多个样品。在选择机型时，要根据实际需要，按单批次检测的样品数量选择相应通道的检测仪。如果检测数量比较少，可以选择通道数比较少的检测仪。如果使用相差悬殊通道数的检测仪，一是利用八道移液器时，技术操作手法要求比较高，若操作不慎，精准度会受到影响，二是造成检测试剂不必要的浪费。相反，如果用单批次处理的样品较多时，选用很少的检测通道，就会造成批内操作时间过长导致误差。

3 试剂配制

3.1 pH8.0缓冲液

分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.23g磷酸二氢钾，用1000ml蒸馏水溶解。

3.2 显色剂

分别取160g二硫代二硝基苯甲酸 （DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20ml缓冲溶液溶解，4℃冰箱保存。

3.3 底物

取25.0mg硫代乙酰胆碱。加3.0ml蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过两周。

3.4 乙酰胆碱酯酶

根据酶的活性情况，用缓冲液溶解，3min的吸光度变化△A值应控制在0.3以上。摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过4天。

在实际检测工作中，一般都是采用仪器生产厂家提供的与检测仪匹配的检测试剂，在使用时按照其使用说明书操作即可

4 检测步骤

4.1 样液制备

4.1.1 样品处理选取有代表性的蔬菜样品，擦掉表面泥土，叶菜类蔬菜剪成1cm左右见方碎片2g，瓜果类、块根 （茎）类取表皮2g，放入提取瓶中，用可调移液器加入10ml缓冲液后，放入多用可调速振荡器中，震荡提取两分钟，静置3～5分钟。

4.1.2 若浸提液清澈无色或颜色较浅，用移液管转移至离心管中做待测液；若浸提液混浊，可用移液管吸取浸提液至离心管0.5ml刻度线，放入微型离心机中离心至上层液清澈后，取出，放在离心管架上做样液；再没有离心机的情况下，也可以采取过滤的方式替代。

4.1.3 若浸提液色素干扰严重，将浸提液转移至另一个提取瓶中，加入0.1～0.5g活性炭 （根据颜色深浅调整），放入多用可调速振荡器，震荡5～6分钟 （脱色时间可根据脱色情况适当延长或缩短），取出静置5～10分钟，用移液管吸取上层液至离心管0.5m刻度线，放入微型离心机中离心至上层液清澈后，取出，放在离心管架上做样液 （样液中不能残留活性炭，若有残留，需进行二次离心处理）。

4.1.4 葱、蒜、萝卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇鸡番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株 （体）浸提，避免次生物物质干扰。

4.1.5 使用不同的仪器，在样液的配制过程会略有不同，有的取1g样品，有的取2g样品，但是与之对应加入的缓冲液分别为5ml和10ml，比例相同。

4.2 对照液配制

对照液直接移取缓冲液即可。

4.3 测试

4.3.1 对照溶液测试：先于试管中加入2.5ml缓冲液，再加入0.1ml酶液、0.1ml显色剂，摇匀后于37℃放置15分钟以上 （每批样品的控制时间应一致）。加入0.1ml底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3分钟的吸光度变化值△A。

4.3.2 样品溶液测试：先于试管中加入2.5ml样品提取液，其他操作与对照溶液测试相同，记录反应3分钟的吸光度变化值△A。

4.3.3 利用多通道移液器移取酶试剂、显色剂及底物时，需要将试剂倒入V型槽中取用。用移液器在测试的微孔板孔内分别加入酶20ul。再用移液器加入对照缓冲液或样品处理液250ul.注：缓冲液必须加入微孔板的第一列： （48、96通道为A1-H1；32通道为1A-8A）。将加入试剂及样品的微孔板放入仪器，按上下键选择 “启动振板”菜单后按 “确认”键启动振板，将酶和样品混匀。振板结束后，让酶试剂与缓冲液或样品液的混合液静置反应10分钟。然后用移液器往测试微孔板内分别加入显色剂10ul、底物10ul，立即放入仪器测量。如果仪器开机后还没有进行对照测量，则需要进行一次对照测量。按 “对照”键进行测量时，仪器自动将第一列作为对照液，其他行作为样品液。测量结束后仪器自动保存当前的对照值，下一次样品测量时就可以不用继续进行对照测量。注：各通道以本列各自对照液的△A为对照计算样品抑制率。若已完成各通道的对照测试，微孔板上所有孔都可作为样品测量，放入仪器后，按 “样品”键启动测量，若设置测量前振板，则仪器在启动测量后先按照设置的振板时间进行振板后进行读板操作。

5 结果的表述计算

5.1 结果计算

5.2 结果判定

结果以酶的被抑制程度 （抑制率）表示。当蔬菜样品提取液对酶的抑制率﹤50%时，蔬菜相对安全；当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，结果为阳性。阳性结果的样品需要重复检验两次以上再确认。

对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定农药的品种和含量。

6 检测过程中应该注意的问题

6.1 样品处理

不同的果蔬品种，在样液制备的过程中，要区别对待，尽最大可能降低蔬果中的次生物、色素等物质的干扰。

6.2 仪器提前预处理

大部分仪器在进行检测前有一段预启动过程，这步不能省略，要严格按照操作规程检测。

6.3 检测环节

缓冲液的配制中，要用蒸馏水或实验室用纯水，不能够用市场上饮用纯净水代替。

检测试剂都有严格的储存条件，要严格按照说明储存，尤其注意的是试剂在邮递过程中保护措施要到位，避免试剂失效。掌握好试剂的有效期，一般为1年。

配制好的试剂，要在指定的条件保存，酶试剂配制好后一周用完，显色剂、底物不超过1个月。

检测时，试剂要提前从冰箱取出，并且恢复室温下才能使用，如果试剂浑浊，要先摇匀后使用。

检测的环境条件，室外温度过高或过低都不能检测，室内的温度要控制在18～32℃。

检测液加入底物后，要立即放入比色槽或处理槽进行测试。

每一次仪器重启检测时，都需要重新测量对照。

当温度条件低于37℃，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试3分钟的吸光度变化△A0值在0.3以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照时间一致才有可比性。

胆碱酯酶空白对照溶液3分钟的吸光度变化△A0值＜0.3的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。

进行对照测量时，1分钟对照吸光度变化△A应在0.1以上，3分钟对照吸光度变化△A应在0.3以上，否则该酶试剂不能继续使用。

6.4 移液过程

移液器使用时，必须遵循器具专用原则：吸取酶、显色剂、底物的移液器贴上专用标签，移取试剂时一一对应使用，避免混用污染试剂。

试剂使用时，必须遵循只出不进原则：从酶、显色剂、底物试剂瓶中移取处的试剂，不得返回原试剂瓶中，以免污染原试剂。

用8通道移液器移取酶试剂、显色剂及底物时，需要将试剂倒入V型槽中取用。在移取过程中，掌握好手法，枪头要垂直对准，不能倾斜，必须保证各道移取的试剂量相同。

对照用缓冲液必须加入微孔板的第一列： （48、96通道为A1-H1；32通道为1A-8A）。

6.5 结果分析

测量结果抑制率A%为 “……”，表示测量结果无效。请检查是否是以下原因引起：①试剂从冰箱取出后，未恢复至室温进行对照测试；②对照测试时间与样品测试时间相隔太久，导致对照与样品测试温度条件相差较大；③被测试样品色素干扰较严重；④反应试剂取用量是否准确。另外，其他非测试孔如空白的孔位可能也会出现“……”。