特发性不育患者Y染色体AZF微缺失筛查及表型分析

王 燕 林 元 黄海龙 林 娜 李 英 陈雪美 王林铄 徐两蒲

福建省妇幼保健院产前诊断中心（福州，350001）

育龄人群中10%～15%的夫妇不育，其中男方因素占40%～50%［1］。造成男性不育的因素很多，以生精障碍最为常见，主要表现为严重少精子症或无精子症。在生精障碍患者中约有30%与遗传因素有关，15%的无精或重度少精不育与Y染色体无精子症因子（AZF）缺失有关，成为男性不育遗传学研究和临床检测的热点。本文对1700例特发性不育男性患者Y染色体AZF缺失情况进行分析。

1 对象和方法

1.1 对象

收集2009年1月～2014年8月于福建省妇幼保健院就诊的无精子症及少精子症男性不育患者，共1816例，通过相关实验室检测及临床检查，排除全身性疾病、泌尿生殖道感染、逆行性射精、输精管阻塞、精索静脉曲张及隐睾等非特发性不育病例116例，最终1700例不明原因，即特发性不育患者，平均年龄31.32（20～49）岁。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取对象2ml外周血加入EDTA的抗凝管，按照全血DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）说明书提取DNA，紫外分光光度计测定DNA含量。

1.2.2 AZF缺失检测 使用Y染色体微缺失基因检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司）进行多重PCR扩增 ，该试剂盒设计了15对PCR引物扩增AZF区域的15个序列标签位点（STS），同时设计1对PCR引物扩增SRY基因，作为内控。共检测位于AZFa区的sY84和sY86，位于AZFb区的sY124、sY127、sY128、sY133、sY134和sY143，位于 AZFc区的sY152、sY239、sY242、sY254和sY255，以及独立存在的sY82和sY145STS。2%琼脂糖凝聚电泳检测扩增结果，100V电压电泳80min，goodview显色，结果用Tanon4100凝胶成像系统观察并拍照。对AZF缺失者重复扩增3次以上确保结果准确。

1.2.3 无精症及少精症诊断标准 男性患者禁欲5～7d，连续3次精液常规检测（至少间隔3d）。且离心沉淀镜检均无精子为无精子症，精子密度＜5×106／ml者为严重少精子症［2］。

2 结果

2.1 AZF缺失率

1700例特发性不育患者AZF总缺失率为6.6%（112／1700）。其中 AZFc缺失率为 4.5%（76／1700）；AZFb+c+sY145 为 1.2% （20／1700）；AZFa 为0.3%（5／1700）、AZFa+b+c 为0.3%（5／1700）；AZFb+c为0.2%（3／1700）；AZFb+c和sY84（AZFa区）为0.1%（2／1700）；AZFc和sY143（AZFb区）为0.1%（1／1700）。

2.2 AZF微缺失类型及其表型（表1）

3 讨论

染色体Yq11区微缺失是导致生精障碍的重要因素［3］，对无精子症和重度少精子症患者进行AZF基因微缺失筛查已被欧洲男科学会推荐为常规检查项目。1976年，Tiepolo等［4］首次提出Y染色体长臂远端存在调控精子发生的基因，并把这一区域称为AZF。Vogt等［5］进一步将AZF划分为AZFa、AZFb和AZFc区。1999年Kent-First等［6］提出除了已报道的3个区域外，在AZFb和AZFc区之间也存在STS片段的丢失，有学者将这个区域命名为AZFd区，主要包括位点sY145，AZFd是否存在目前仍然存在争议，最新修订的欧洲男科指南将sY145单独列出。国内外研究表明不育男性AZF区的缺失率为1%～55%［7-8］。意大利男性不育患者中Y染色体微缺失率为5%，其中AZFc区缺失率为3.2%，AZFb+c区自由缺失率为0.6%［7］。而德国对无精子症和严重少精子症患者的研究表明，Y染色体微缺失率仅为1.8%，其中AZFc区缺失率为1.5%［9］。有报道，我国无精子症和严重少精子症患者AZF微缺失率约为11.5%，其中AZFc缺失率为6.1%，AZFb+c缺失率为1.3%，AZFa+b+c缺失率为0.1%［10］。本研究1700例特发性不育患者中AZF总缺失率为6.6%（112／1700），其中AZFc和AZFb+c+sY145缺失最为常见，发生率分别为4.5%（76／1700）和1.2%（20／1700），未发现AZFb单独缺失的患者。不同国家、地区Y染色体AZF微缺失发生率的变化与研究人群的地域和种族不同，以及研究群体的数量、入选标准、检测方法等不同有关，其中研究人群的构成为主要因素。

表1 112例特发性不育患者AZF微缺失构成及其表型

经过数年研究，Y染色体AZF微缺失的基因型与其表型的关系得到了部分证实，AZFa全缺失常表现为唯支持细胞综合征I型（SCOS），即无精原细胞，仅有支持细胞出现，同时有睾丸体积缩小［11］。AZFb缺失与无精子症或严重少精子症相关，病理表现为生精受阻，停滞在精母细胞阶段，睾丸内可见精原细胞和初级精母细胞，但无精子生成［12］。AZFc缺失有多种表型，精子计数可以从无到正常，但畸形精子明显增多，组织学类型可能随病理损害时间而不断发展，即随着时间的推移生精细胞的数量逐渐减少［12］。AZFb+c联合缺失表现为严重生精功能阻滞［13］。

本研究中AZFc缺失患者76例，其中35例为无精症，41例为严重少精子症；其它AZF微缺失类型均表现为无精症。AZFa、AZFb、AZFb+c缺失的患者表现为无精症，即使通过显微睾丸取精（TESE）也很难获得精子，AZFc缺失患者通过TESE获得精子的成功率可达75%［14］，从而可以通过卵泡浆内单精注射助孕，生育下一代。AZFc缺失的患者精子数量随着时间推移进行性减少，故可以考虑冷冻精液备用。因此，在应用辅助生殖技术治疗之前对患者进行Y染色体AZF检测，可以明确部分患者精子生成障碍的原因，从而避免不必要的治疗，也可以预测辅助生育结局。

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