近年无锡市奶牛结核病的流行病学调查

顾舒舒 范锋（江苏省无锡市动物疫病预防控制中心 214000）

近年无锡市奶牛结核病的流行病学调查

顾舒舒 范锋（江苏省无锡市动物疫病预防控制中心 214000）

结核病是由结核分支杆菌引起的一种人畜共患慢性传染病。牛结核病主要是由牛分枝杆菌所引起，主要特征为在多种组织器官形成干酪样坏死、肉芽肿（结核结节）和钙化结节病变。该病危害严重，被国际兽医局（OIE）列为B类动物疫病[1]，我国列为二类传染病。本病可经呼吸道、消化道、交配等方式感染。在家畜中，牛最易感染结核病，尤以奶牛多见，其次是水牛和黄牛[2]。近年来，随着人们生活水平的提高，对奶制品特别是牛奶需求量的增加，带动了奶牛业的迅猛发展，牛结核病也日益受到了密切关注。目前江苏省奶牛结核病按照现阶段国家动物疫病监测计划分类标准属二类地区，奶牛结核病不治疗，而采取严格的隔离、扑杀患病牛的政策。

牛结核病的检测方法大体可分为三类：第一类是病原学检查法，如涂片染色镜检、细菌培养等，该法是最确实的方法之一，但由于染色法检出的细菌只能说明有抗酸杆菌，不能准确鉴定出结核分枝杆菌和非典型分支杆菌，因而缺乏特异性[3]；而细菌培养检出率低，结核菌生长缓慢，一般需10～30d才能看到菌落[4]，且有10～20%的病例结核菌培养失败[5,6]，因此，该法在牛结核菌的临床诊断中不易推广。第二类是免疫学方法，如皮内变态反应、胶体金和ELISA等方法，PPD皮内变态反应试验是目前最常用的奶牛结核病检测方法，我国普遍采用单纯颈部皮试变态反应（SCT）进行检测，欧盟（EU）国家广泛使用比较皮试变态反应（CCT）进行检测[7]，而胶体金和ELISA检测虽然简单易行，但目前实际价格昂贵，大规模实施的成本过高。第三类是分子生物学方法，如核酸探针、PCR和DNA图谱等方法，该法需特殊的仪器设备，对实验室条件以及操作人员的技术要求较高，只适用于实验室研究，不适用于基层的推广应用。有报道称，新型的γ-干扰素（IFN-γ）体外释放试验相比SCT和CCT而言，能保持较高的灵敏度和较好的特异性[8]。

于2011～2013年间，对无锡市所有存栏的奶牛进行了奶牛结核病的流行病学调查，本文旨在为无锡市奶牛结核病的诊断和防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

精密电子天平、高速低温离心机、恒温培养箱、超净工作台、显微镜、微量可调移液器、超纯化水机、电动推毛剪、微量金属注射器、注射兽用16#针头、游标卡尺、酶标仪等。

1.2 试剂与耗材

牛型PPD、禽型PPD购自中国兽医监察所。BOVIGAMTM试剂盒购自瑞士Prionics公司。

1.3 被检动物

2011～2013年间，无锡市所有存栏的奶牛，除初生犊牛、怀孕后期母牛及隔离病牛外，其余均为调查对象。

1.4 试验方法

1.4.1 单纯颈部皮试变态反应（SCT）

参照国家标准《动物结核病诊断技术（GB/T18645-2002）》，对无锡市所有存栏奶牛采用SCT进行检测，使用国产牛型PPD，剂量为2000U（IU）/头，分别于注射前和注射后72h测量皮肤厚度，并计算出皮厚差，依据国家标准判断结果，对粗筛和二次复核均为可疑的判定为阳性。

1.4.2 γ-干扰素（IFN-γ）体外释放试验

对所有规模奶牛场（存栏100头以上）随机挑选部分奶牛，同时采用IFN-γ释放试验进行检测。奶牛尾静脉无菌采血5ml/头，将采集的血液置于肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒混匀，使肝素钠溶解。室温下将血样运送到实验室，在采血后8h内进行刺激培养。将全血样品无菌分装至24孔板中，每份血样分装3孔，1.5ml/孔。向各孔中分别无菌加入100μl PBS、禽型PPD、牛型PPD，震荡混匀1min。将含有血液与抗原的24孔板置于37℃湿温培养箱中孵育24h。次日从各培养孔吸取500μl血浆上清转入1.5ml离心管中，即为刺激产生的γ-干扰素上清。以Prionics公司购得的试剂盒检测牛全血上清液中的γ-干扰素，具体操作参照试剂盒说明书进行。

结果判定标准：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的0D值-禽型PPD刺激上清的0D值≥0.1判为阳性；牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值＜0.1或牛型PPD刺激上清的0D值-禽型PPD刺激上清的0D值＜0.1，则判为阴性。

2 结果

2.1 SCT检测结果

2011～2013年间，对全市7个区、2个县的奶牛用SCT检测奶牛结核病发病情况，共检测奶牛25613头次，其中结核阳性奶牛292头，结核阴性奶牛25321头次，阳性率为1.14%；2011年共检测奶牛9020头，其中结核阳性奶牛147头，结核阴性奶牛8873头，阳性率为1.63%；2012年共检测奶牛8796头，其中结核阳性奶牛89头，结核阴性奶牛8707头，阳性率为1.01%；2013年共检测奶牛7797头，其中结核阳性奶牛56头，结核阴性奶牛7741头，阳性率为0.72%。检测结果见表1。

2.2 两种方法检测结果

对其中13个规模奶牛场，分别采用SCT和IFN-γ体外释放试验同时进行检测，共计检测奶牛14000头次。

SCT检测结果为：结核阳性奶牛105头，结核阴性奶牛13895头次，其中初筛可疑牛15头次，阳性率0.75%，其中2011年检测出结核阳性奶牛56头，结核阴性奶牛3944头，阳性率1.40%；2012年检测出结核阳性奶牛34头，结核阴性奶牛4966头，阳性率0.68%；2013年检测出结核阳性奶牛15头，结核阴性奶牛4985头，阳性率0.30%。具体结果见表2。

IFN-γ体外释放试验检测结果显示：ELISA判定阳性奶牛72头，ELISA判定阴性奶牛13928头次，阳性率0.51%，其中2011年检测出结核阳性奶牛45头，结核阴性奶牛3955头，阳性率1.13%；2012年检测出结核阳性奶牛21头，结核阴性奶牛4979头，阳性率0.42%；2013年检测出结核阳性奶牛6头，结核阴性奶牛4994头，阳性率0.12%。具体结果见表3。

3 分析与讨论

3.1 奶牛结核病的发病情况

2011～2013年间，无锡市奶牛结核病的阳性率呈现逐年降低的趋势（见图1）。结核病阳性率从2011年的1.63%降到2012年的1.01%，同比降低了38.04%，2013年的阳性率从2012年的1.01%降至0.72%，同比降低了28.71%，下降幅度逐渐缩小。

图1 2011～2013年间无锡市奶牛结核病发病情况

表1 2011～2013年间无锡市奶牛结核病SCT监测结果

表2 2011～2013年间无锡市规模奶牛场部分奶牛结核病SCT检测结果

表3 2011～2013年间规模奶牛场部分奶牛结核病IFN-γ体外释放试验检测结果

通过对奶牛结核病进行定期监测和筛查，对入境奶牛进行严格检疫，及时淘汰病牛，隔离可疑牛，坚持检疫与淘汰相结合的原则，三年来，无锡市奶牛结核病的发病率在一定程度上得到了控制。结核病阳性率下降幅度逐渐缩小，可能是由于全市奶牛的饲养量逐年减少，同时阳性牛在每年的筛查中被淘汰，结核病传染的风险降低，因此阳性率在降低的同时，下降幅度也逐渐缩小。

3.2 两种检测方法的对比

2011～2013年间，采用SCT和IFN-γ体外释放试验两种方法，对13个规模奶牛场的检测结果显示，SCT的阳性检出率明显高于IFN-γ试验，而其阳性、阴性符合数却低于IFN-γ试验，因此IFN-γ试验具有更强的特异性。

IFN-γ体外释放试验的阳性数与SCT检测阳性数的比值呈现逐年减小的趋势（见图2），一方面说明SCT检测法存在较多的假阳性，而IFN-γ体外释放试验很大程度上排除了这些假阳性，提高了检测的准确率；另一方面，由于阳性检出准确率的提高，阳性奶牛被及时淘汰、扑杀，因此阳性奶牛数逐年减少，阳性率呈现逐年下降的趋势（见图3）。

4 结论

2011～2013年间，无锡市奶牛结核病的阳性率总体呈下降趋势，通过坚持检疫与淘汰相结合的原则，结核病阳性率的下降幅度也逐渐缩小。调查发现，及时淘汰、扑杀结核病阳性奶牛，对饲养环境进行严格消毒，降低奶牛群的饲养密度，加强饲养管理，提高奶牛自身免疫力等措施，可以有效降低奶牛结核病的发病率。经检测确诊为结核病阳性的奶牛被及时扑杀，据统计，三年来共扑杀奶牛292头。此次调查中发现，多数奶牛结核病检测阳性的牛为从外地新购入奶牛，在隔离观察期内未出现明显症状，但SCT和IFN-γ体外释放试验均检测为阳性，因此，下一步要加强调入管理，防止疫病传入，严格执行调入动物审批制度，调入的奶牛经调出地动物卫生监督机构检测合格的同时，在调入本地后要采取严格完善的隔离措施，隔离饲养45d后方可混群饲养。

通过对SCT和IFN-γ体外释放试验两种方法连续三年的检测结果对比，IFN-γ试验显示出了简单、快捷、灵敏度高、特异性强等特点，使实验结果更为客观、可靠，可以有效解决基层动物监督、疫病防控机构在实施奶牛结核病检疫、隔离、扑杀措施过程中的一系列问题，诸如多次繁琐的测量观察，大量的人力物力参与、主观判定阳性实施扑杀的困难等，因此非常适宜结核病检疫和监测技术的推广。但是，IFN-γ试验仍存在成本较高等问题，且国内目前尚无正规批准试剂盒，但农业部2013年国家动物疫病监测与流行病学调查计划“对监测阳性的动物，可用外周血IFN-γ体外释放检测法（按试剂盒说明书）进行确诊”[9]的建议，在本研究的基础上，将探讨采用结核菌素皮内变态反应初筛，初筛阳性或疑似的进行IFN-γ试验确诊的方法。

图2 IFN-γ体外释放试验的阳性数与SCT检测阳性数的比值

图3 2011～2013年间无锡市规模奶牛场奶牛结核病的发病情况

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[9]农业部关于印发《2013年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》的通知（农医发【2013】9 号）.