壳聚糖基水凝胶对肿瘤在体内外生长的影响研究*

王 慧，宋福来，刘万顺，韩宝芹

（中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛266003）

壳聚糖是一种天然高分子聚合物，其来源广泛、储量丰富，无毒，具有良好的生物相容性、生物可降解性和吸附性，被用做多种生物功能材料［1］。目前，壳聚糖及其衍生物的辅助免疫、抑制癌细胞及肿瘤生长等作用和作为抗肿瘤药物转运载体的研究正日益受到国内、外学者的广泛关注［2］。但壳聚糖在水中的溶解性差，且在酸溶液中不稳定，这在很大程度上限制了它的应用［3］。

水凝胶是能够吸收大量水并急速增大体积的高溶胀亲水性聚合物［4］。作为一种新型生物材料，可用于提高局部药物浓度、缓释控释以及原位植入，已广泛应用于药物载体和组织工程学研究［5］。目前关于水凝胶的抗肿瘤应用还少有报道。壳聚糖基水凝胶可以改善壳聚糖在液体环境中的稳定性，并且表现出对温度或pH的敏感性［6］。实验所用壳聚糖基水凝胶（水凝胶）是一种温敏性水凝胶，37℃成胶时间最短，可在体内原位成胶［7］。本研究从体内、体外两方面研究水凝胶对肿瘤生长的影响作用，为壳聚糖基水凝胶作为抗肿瘤医用材料的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

壳聚糖基水凝胶（水凝胶）由青岛博益特公司提供。RPMI1640培养基（Gibco），新生牛血清（Hyclone），胰蛋白酶和 MTT（Sigma），小鼠白介素-2（IL-2）Elisa试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子－α（TNF-α）Elisa试剂盒及小鼠干扰素－γ（IFN-γ）Elisa试剂盒（南京建成生物工程研究所），其他试剂均为国产分析纯。

倒置显微镜（日本 Olympus），超净工作台、BB16FCO2培养箱（上海力申科学仪器有限公司），全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific）。

1.2 实验材料

人宫颈癌细胞Hela及人胃癌细胞SGC-7901由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供；小鼠腹水瘤S180细胞购自中国海洋大学药物研究所。昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重18～22g，购自青岛市药检所。

1.3 实验方法

1.3.1 水凝胶溶液制备 无菌条件下，以无血清的RPMI1640培养基为介质，加入一定质量的水凝胶，分别配置 成 0.001、0.002 5、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25g·mL－1的水凝胶溶液，于37℃，180r·min－1摇床震荡24h充分溶解后，按10%体积分数添加新生牛血清，于4℃备用。

1.3.2 对体外培养的肿瘤细胞增殖的影响 选取对数期的 Hela和SGC-7901，经0.25%胰酶消化后，按1×104个·mL－1的密度接种于96孔板，每孔200μL。设不同浓度水凝胶实验组、细胞对照组及空白对照组，每组5个复孔。37℃、5%CO2常规培养24h，待细胞贴壁完全后，弃去原培养基，实验组分别添加不同浓度的水凝胶溶液，细胞对照组添加等量的培养基。所用培养基为含10%新生牛血清的RPMI1640培养基。

上述各组细胞分别培养2、4及6d，于倒置显微镜下观察细胞形态。MTT法测其在492nm处吸光度。按下列公式计算相对增殖率（RGR）。

其中：Ao，Al，A2分别为空白组，实验组及对照组的吸光值。

1.3.3 体内抑瘤实验 实验动物饲养一周以适应环境。取腹腔接种7d，生长良好的S180荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死。无菌条件下抽取腹水，离心，弃上清，用生理盐水调细胞浓度为2×107个·mL－1，接种于正常小鼠左前肢腋窝皮下，每只0.2mL。造模24h后随机分为高剂量水凝胶组、低剂量水凝胶组和模型组，每组10只。采用腹腔注射方式给药，其中实验组注射剂量分别为25和12.5mL·kg－1，模型组每只注射生理盐水0.5mL，隔天一次，共14d。实验动物于末次给药后24h，采血后处死。给药前后的体重变化用于评价水凝胶对机体的毒副作用。剖离瘤块，称取瘤重，计算抑瘤率。分离胸腺、脾脏，并称重，分别计算胸腺指数和脾脏指数。血液于室温存放4h后以3 000r·min－1离心15 min提取血清。按照Elisa试剂盒说明书测血清中TNF-α、IL-2及IFN－γ含量。计算公式如下：

1.4 统计学分析

实验数据以应用SPSS13.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA）。

2 结果

2.1 水凝胶对Hela及SGC-7901体外增殖的影响

水凝胶对体外培养的Hela细胞和SGC-7901细胞生长增殖的影响见图1和2。图1（1）显示了实验组和对照组Hela细胞生长的状态，图1（2）显示了实验组和对照组SGC-7901细胞生长的状态，可见对照组细胞排列整齐，状态良好；各实验组均有部分细胞呈现不同程度的变圆现象，并伴有细胞碎片出现，该现象随水凝胶作用时间的延长趋于明显，并且低浓度范围实验组的细胞密度明显低于对照组。

图2显示了在不同浓度水凝胶作用下的细胞相对增殖率。2d时，与细胞对照组相比，水凝胶浓度为0.001、0.002 5及0.005g·mL－1的3个实验组的2种细胞生长均呈现显著性或极显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。3个组对 Hela细胞的相对增殖率分别为80.40%、88.94%和90.10%，对 SGC-7901 的相对 增殖率分别为86.52%、92.83%和89.17%；4d时，水凝胶浓度为0.001和0.01g·mL－1的实验组的Hela细胞生长呈现显著性差异，相对增殖率分别为87.65%和91.84%。6d时，水凝胶浓度为0.001和0.0025g·mL－1的2个实验组的Hela细胞生长呈现极显著性差异，相对增殖率分别为83.81%和86.13%。水凝胶浓度为0.025、0.05、0.1、0.25g·mL－1的4个实验组在3个时间点对两种细胞生长的影响作用不明显。实验结果显示了水凝胶对体外培养的Hela细胞和SGC-7901细胞的生长具有显著抑制作用，且在低浓度时效果较好。

图1 不同水凝胶浓度6d时对Hela细胞及SGC-7901细胞形态的影响Fig.1 Effects of CH on the morphology of Hela and SGC-7901treated for 6d

图2 水凝胶对Hela细胞及SGC-7901细胞体外增殖的影响Fig.2 Effects of CH on the proliferation of Hela and SGC-7901in vitro

2.2 水凝胶对荷瘤小鼠肿瘤组织生长的影响

给药14d，S180荷瘤小鼠实验组饮食正常，状态良好。体重变化方面，低剂量组小鼠体重高于模型组，高剂量组小鼠体重略低于模型组，但均没有显著性差异，显示了水凝胶的毒副作用不明显（见表1）。肿瘤体积方面，实验组肿瘤体积明显小于模型组，如图3所示。与模型组比较，实验组瘤重减小，其中低剂量水凝胶组的瘤重与模型组瘤重相比呈现显著性差异（P＜0.05），显示了低剂量组水凝胶对肿瘤组织生长的抑制作用。

表1 水凝胶对实体瘤S180小鼠肿瘤生长的影响Table 1 Effect of CH on the growth of solid S180tumor in mice（n＝10，m±SD）

图3 水凝胶对小鼠S180肿瘤形态的影响Fig.3 Effect of CH on the morphology of solid S180tumor

2.3 水凝胶对荷瘤小鼠免疫系统的影响

水凝胶对荷瘤小鼠免疫系统的影响结果见表2和图4。由表2可见，水凝胶可提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数，其中低剂量水凝胶组的胸腺指数较模型组，呈现显著性差异（P＜0.05）。图4显示了低剂量水凝胶组和高剂量水凝胶组可显著增加TNF－α、IL-2及IFN-γ三种细胞因子的表达水平，与对照组相比，两实验组的 TNF－α、IL-2水平呈现显著性差异（P＜0.05），IFN-γ水平呈现极显著性差异（P＜0.01），显示了水凝胶具有提升免疫力，增强免疫系统的防御功能。

表2 水凝胶对荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的影响Table 2 Effects of CH on thymus index and spleen index in tumor-bearing mice（n＝10，M±SD）

图4 水凝胶对荷瘤小鼠血清中TNF－α、IL-2及IFN－γ水平的影响Fig.4 Effects of CH on the of serum levels of TNF-α，IL-2and IFN-γin tumor-bearing mice

3 讨论

本研究探讨了水凝胶对肿瘤在体内外生长的影响。体外细胞增殖实验表明，低浓度水凝胶一方面能在一定程度上抑制肿瘤细胞生长，破坏肿瘤细胞正常形态；另一方面不产生细胞毒性，具有良好的安全性。其体外抑瘤效果在2d时最为明显，随后逐渐减弱，6d时略有增强。同时实验组可观察到微小胶体颗粒存在，说明水凝胶溶液内有少许重新成胶现象，其作用缓慢可能与成胶后的缓释有关。

体内抑瘤实验效果明显，水凝胶能更好地发挥抗肿瘤活性，优于体外效果。在体内实验中，水凝胶不仅能抑制实体瘤的生长，还可以提高免疫器官指数、激活免疫细胞，诱导 TNF－α、IL-2、IFN-γ与抗肿瘤相关的细胞因子分泌，增强机体的免疫能力，进而抵御肿瘤细胞的侵袭。无论体内还是体外实验，壳聚糖基水凝胶在低浓度或低剂量时，均产生较好的抑瘤作用，并未出现量效关系，相关实验也未得出统一意见［8］，有关机理尚需进一步研究。

壳聚糖不仅可以用作抗肿瘤药物的载体，如纳米微球［9］、凝胶缓释体系等［10］；大量研究表明，其本身也具有一定的抗肿瘤活性。文镜等的研究表明低聚壳聚糖能够抑制体外培养的肿瘤细胞的DNA合成，发挥抗肿瘤作用［11］。Harish等通过实验发现水溶性低分子量壳聚糖能够诱导小鼠艾氏腹水瘤（EAT）细胞凋亡、抑制肿瘤介导的血管生成［12］。Maeda等发现相对分子质量为21和46kD的壳聚糖可抑制S180生长，增强肠上皮和脾的自然杀伤（NK）细胞的活性，且此作用较分子量高的壳聚糖好，并推测出低分子量壳聚糖可能是通过提高肠内免疫功能来发挥抗肿瘤作用［13］。C.Qin等通过酶解得到不同分子量壳聚糖，研究它们对腹水移植S180的小鼠的肿瘤生长影响，结果显示高分子量壳聚糖的抗肿瘤效果要优于低分子量壳聚糖［14］。王芳宇等通过实验证明，水溶性壳聚糖能显著促进荷瘤小鼠 NO、TNF、IFN-γ的生成，提高 NK 细胞活性［15］。另有多项研究发现，壳聚糖及其衍生物的氨基具有明显的免疫特性，它们并不直接杀死肿瘤细胞，而是通过对机体的免疫调节方式间接达到抑制肿瘤生长的目的［8］。目前，大多抗肿瘤药物仍存在耐药问题和易引发不良反应等缺点，而且价格也较昂贵。本研究发现，以天然产物制成的壳聚糖基水凝胶能够表现出良好的抗肿瘤活性和生物安全性，作为抗肿瘤医用材料应用于体内具有可行性，为肿瘤治疗提供新的手段。

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